Summary

Isolamento, cultura e indução adipogênica de células-tronco originais de adipose da crista neural do tecido adipogênico periaorótico

Published: March 02, 2020
doi:

Summary

Apresentamos um protocolo para o isolamento, cultura e indução adipogênica de células-tronco derivadas de adipose derivados da crista neural (NCADSCs) do tecido periártico adiposo de Wnt-1 Cre+/-; Rostou rosa26RFP/+. Os NCADSCs podem ser uma fonte de ADSCs facilmente acessível para modelar adipogênese ou lipogênese in vitro.

Abstract

Uma quantidade excessiva de tecido adiposo ao redor dos vasos sanguíneos (tecido adiposo perivascular, também conhecido como PVAT) está associada a um alto risco de doenças cardiovasculares. Os ADSCs derivados de diferentes tecidos adiposos apresentam características distintas, e os do PVAT não foram bem caracterizados. Em um estudo recente, relatamos que alguns ADSCs no tecido adiposo do arco periártico (PAAT) descendem das células da crista neural (NCCs), uma população passageira de células migratórias originárias do ectoderm.

Neste artigo, descrevemos um protocolo para isolar AS NCCs vermelhas fluorescentes (RFP) rotuladas pelo PAAT do Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ camundongos e indução de sua diferenciação adipogênica in vitro. Resumidamente, a fração vascular estromal (SVF) é enzimáticamente dissociada do PAAT, e os ADSCs derivados da crista neural RFP+ neural (NCADSCs) são isolados pela classificação celular ativada por fluorescência (FACS). Os NCADSCs se diferenciam tanto em adipócitos marrons quanto brancos, podem ser crioreservadoss e manter seu potencial adipogênico para ~3-5 passagens. Nosso protocolo pode gerar ADSCs abundantes a partir do PVAT para modelar adipogênese PVAT ou lipogênese in vitro. Assim, esses NCADSCs podem fornecer um sistema valioso para estudar os interruptores moleculares envolvidos na diferenciação de PVAT.

Introduction

A prevalência de obesidade está aumentando em todo o mundo, o que aumenta o risco de doenças crônicas relacionadas, incluindo doenças cardiovasculares e diabetes1. PvAT envolve vasos sanguíneos e é uma das principais fontes de fatores endócrinos e paracrinos envolvidos na função vasculatura. Estudos clínicos mostram que o alto teor de PVAT é um fator de risco independente de doenças cardiovasculares2,3, e sua função patológica depende do fenótipo das células-tronco derivadas de adiposos constituintes (ADSCs)4.

Embora linhas celulares ADSC como a murina 3T3-L1, 3T3-F442A e OP9 sejam modelos celulares úteis para estudar adipogênese ou lipogênese5,os mecanismos regulatórios para adipogênese diferem entre linhas celulares e células primárias. Os ADSCs na fração de célulavascular estrônita (SVF) isolaram-se diretamente dos tecidos adippose e induzidos a diferenciar em adipócitos provavelmente recapitulando na adipogênese vivo e lipogênese6. No entanto, a fragilidade, a flutuação e as variações de tamanho e imunofenótipos dos ADSCs tornam seu isolamento direto desafiador. Além disso, os diferentes procedimentos de isolamento também podem afetar significativamente a capacidade potencial fenótipo e adipogênica dessas células7,enfatizando assim a necessidade de um protocolo que mantenha a integridade do ADSC.

O tecido adiposo é tipicamente classificado como o tecido adiposo branco morfologicamente e funcionalmente distinto (WAT), ou o tecido adiposo marrom (BAT)8, que abriga ADSCs distintos9. Embora as ADSCs isoladas de WATs subcutâneos e subcutâneos foram caracterizadas em estudos anteriores9,10,11,12, menos se sabe em relação aos ADSCs da PVAT que é composto principalmente por BAT13.

Em um estudo recente, descobrimos que uma parte dos ADSCs residentes no tecido adiposo do arco periártico (PAAT) são derivados de células de crista neural (NCCs), uma população transitória de células progenitoras migratórias que se originam do ectoderm14,15. Os camundongos transgênicos Wnt1-Cre foram usados para rastrear o desenvolvimento de células de crista neural16,17. Cruzamos os mouses Wnt1-Cre+ com ratos Rosa26RFP/+ para gerar O Cre Wnt-1+/-; Os camundongos Rosa26RFP/+, nos quais as NCCs e seus descendentes são rotulados com proteína fluorescente vermelha (RFP) e são facilmente rastreados in vivo e in vitro15. Aqui, descrevemos um método para isolar adsCs derivados da crista neural (ADSCs derivados de NC, ou NCADSCs) do PAAT do mouse e induzir os NCADSCs a diferenciar em adipócitos brancos ou adipócitos marrons.

Protocol

O protocolo animal foi revisto e aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Xangai Jiao Tong. 1. Geração de Wnt-1 Cre+/-; Ratos Rosa26RFP/+ Cross Wnt-1 Cre+/- mouses16 com rosnado Rosa26RFP/+ 18 para gerar Wnt-1 Cre+/-; Rostou rosa26RFP/+. Ratos domésticos um ciclo claro/escuro de 12h em uma instalação livre de patógenos a 25 °C e 45% de umida…

Representative Results

Usando o protocolo descrito acima, obtivemos ~0,5-1.0 x 106 ADSCs de 5-6 Wnt-1 Cre+/-; Rostou rosa26RFP/+ (48 semanas, homem ou mulher). O fluxo grama de coleta de PAAT de camundongos é apresentado na Figura 1. A morfologia dos NCADSCs era semelhante ao ADSC de outros tecidos adiposos de camundongos. As NCADSCs cultivadas atingiram 80-90% de confluência após 7-8 dias de cultura, e os NCADSCs tiveram uma morfologia expandida seme…

Discussion

Neste estudo, apresentamos um método confiável para o isolamento, cultura e indução adipogênica de NCADSCs extraídos do PVAT do Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ camundongos transgênicos projetados para produzir RFP+ ADSCs. Relatórios anteriores mostram que não há diferença significativa na expressão de marcadores de células-tronco mesenquinais multipotentes gerais (MSCs) em NCADSCs e não NCADSCs22, e que os NCADSCs têm um forte potencial para diferenciar em…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Programa Nacional de P&D da China (2018YFC1312504), Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81970378, 81670360, 81870293) e Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (17411971000, 17140902402) forneceram os fundos para este estudo .

Materials

4% PFA BBI life sciences E672002-0500 Lot #: EC11FA0001
Agarose ABCONE (China) A47902 1% working concentration
Anti-cebp/α ABclonal A0904 1:1000 working concentration
Anti-mouse IgG, HRP-linked CST 7076 1:5000 working concentration
Anti-perilipin Abcam AB61682 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54
Anti-PPARy SANTA CRUZ sc-7273 0.2 μg/mL working concentration
Anti-rabbit IgG, HRP-linked CST 7074 1:5000 working concentration
Anti-β-Tubulin CST 2146 1:1000 working concentration
BSA VWR life sciences 0332-100G 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008
Collagenase, Type I Gibco 17018029
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902 0.1 µM working concentration
Erythrocyte Lysis Buffer Invitrogen 00-4333
FBS Corning R35-076-CV 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS
HBSS Gibco 14025092
HDMEM Gelifesciences SH30243.01 Lot #: AD20813268
IBMX Sigma-Aldrich I7018 0.5 mM working concentration
Insulin Sigma-Aldrich I3536 1 μg/mL working concentration
Microsurgical forceps Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-F201A-1
Microsurgical scissor Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-H121A
Oil Red O solution Sigma-Aldrich O1516 0.3% working concentration
PBS (Phosphate buffered saline) ABCONE (China) P41970
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PrimeScript RT reagent Kit TAKARA RR047A Lot #: AK4802
RNeasy kit TAKARA 9767 Lot #: AHF1991D
Rosa26RFP/+ mice JAX No.007909 C57BL/6 backgroud; male and female
Rosiglitazone Sigma-Aldrich R2408 1 μM working concentration
Standard forceps Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-F424
Surgical scissor Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-S231
SYBR Premix Ex Taq TAKARA RR420A Lot #: AK9003
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T2877 10 nM working concentration
Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice JAX No.009107 C57BL/6 backgroud; male and female

References

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Cite This Article
Qi, Y., Miao, X., Xu, L., Fu, M., Peng, S., Shi, K., Li, J., Ye, M., Li, R. Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (157), e60691, doi:10.3791/60691 (2020).

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