Summary

Isolamento, cultura e induzione adipogenica di cellule staminali adipose originali adipose-derivate da cellule staminali periaortiche

Published: March 02, 2020
doi:

Summary

Vi presentiamo un protocollo per l’isolamento, la coltura e l’induzione adipogenica delle cellule staminali derivate dalla cresta neurale derivate da cellule staminali derivate da adiposo (NCADSC) dal tessuto adiposo periaortico del Wnt-1Cre Topi Rosa26RFP/z. Le NCADSC possono essere una fonte facilmente accessibile di ADSC per la modellazione dell’adipogenesi o della lipogenesi in vitro.

Abstract

Una quantità eccessiva di tessuto adiposo che circonda i vasi sanguigni (tessuto adiposo perivascolare, noto anche come PVAT) è associato ad un alto rischio di malattie cardiovascolari. Gli ADSC derivati da diversi tessuti adiposi mostrano caratteristiche distinte, e quelli del PVAT non sono stati ben caratterizzati. In un recente studio, abbiamo riferito che alcuni ADSC nel tessuto adiposo arco periaortico (PAAT) discendono dalle cellule della cresta neurale (NCC), una popolazione transitoria di cellule migratorie provenienti dall’ectoderma.

In questo articolo, descriviamo un protocollo per l’isolamento delle cCI con etichettatura RFP (proteina fluorescente rossa) dal PAAT del Wnt-1Cre MiriRosa26 RFP/z e inducendo ne la differenziazione adipogenica in vitro. In breve, la frazione vascolare stromale (SVF) è enzimaticamente dissociata dal PAAT, e la RFP ADSC derivato dalla cresta neurale (NCADSC) sono isolati dalla fluorescenza activated cell sorting (FACS). Le NCADSC si differenziano in adipociti sia marroni che bianchi, possono essere crioconservate e mantenere il loro potenziale adipogenico per passaggi da 3 a 5 dollari. Il nostro protocollo può generare ABbondanti ADSC dal PVAT per la modellazione dell’adipogenesi PVAT o della lipogenesi in vitro. Pertanto, queste NCADSC possono fornire un valido sistema per studiare gli interruttori molecolari coinvolti nella differenziazione PVAT.

Introduction

La prevalenza dell’obesità è in aumento in tutto il mondo, il che aumenta il rischio di malattie croniche correlate, tra cui malattie cardiovascolari e diabete1. IL PVAT circonda i vasi sanguigni ed è una delle principali fonti di fattori endocrini e paracrini coinvolti nella funzione di vascolatura. Studi clinici dimostrano che l’elevato contenuto di PVAT è un fattore di rischio indipendente della malattia cardiovascolare2,3, e la sua funzione patologica dipende dal fenotipo delle cellule staminali derivate da adiposa costitutive (ADSC)4.

Anche se le linee cellulari ADSC come il murino 3T3-L1, 3T3-F442A e OP9 sono utili modelli cellulari per studiare l’adipogenesi o la lipogenesi5, i meccanismi regolatori per l’adipogenesi differiscono tra le linee cellulari e le cellule primarie. Gli ADSC nella frazione di cellula vascolare stromale (SVF) isolati direttamente dai tessuti adiposi e indotti a differenziarsi in adipociti molto probabilmente ricapitolano in vivo adipogenesi e lipogenesi6. Tuttavia, la fragilità, la galleggiabilità e le variazioni di dimensioni e immunofenotipi degli ADSC rendono difficile il loro isolamento diretto. Inoltre, le diverse procedure di isolamento possono anche influenzare in modo significativo il fenotipo e la capacità potenziale adipogenica di queste cellule7, sottolineando così la necessità di un protocollo che mantenga l’integrità dell’ADSC.

Il tessuto adiposo è tipicamente classificato come il tessuto adiposo bianco (WAT) morfologicamente e funzionalmente distinto, o il tessuto adiposo marrone (BAT)8, che ospita ADSC distinti9. Mentre gli ADSC isolati dai WAT sottocutanei perigonadali e inguinali sono stati caratterizzati negli studi precedenti9,10,11,12, meno è noto per quanto riguarda gli ADSC da PVAT che è composto principalmente da BAT13.

In uno studio recente, abbiamo scoperto che una parte degli ADSC residenti nel tessuto adiposo dell’arco periaortico (PAAT) è derivata da cellule della cresta neurale (NCC), una popolazione transitoria di cellule progenitrici migratorie che provengono dall’ectoderma14,15. I topi transgenici Wnt1-Cre sono stati utilizzati per tracciare lo sviluppo delle cellule della cresta neurale16,17. Abbiamo attraversatoi topi Wnt1-Cre con i topi Rosa26RFP/ s per generare Wnt-1Cre. I topi Rosa26RFP/z, in cui gli NCC e i loro discendenti sono etichettati con proteine fluorescenti rosse (RFP) e sono facilmente rintracciabili in vivo e in vitro15. In questo articolo viene descritto un metodo per isolare gli ADSC derivati dalla cresta neurale (ADSC derivati da NC o NCADSC) dal PAAT del topo e induriamo gli NCADSC a differenziarsi in adipociti bianchi o adipociti bruni.

Protocol

Il protocollo sugli animali è stato rivisto e approvato dal Comitato per la cura degli animali della Shanghai Jiao Tong University. 1. Generazione di Wnt-1Cre Rosa26RfP/ Topi Cross Wnt-1 Cre1 – Topi16 con rosa26RFP / mouse18 per generare Wnt-1 Cre. Topi Rosa26RFP/z. I topi della casa in un ciclo di luce/buio di 12 h in una struttura priva di agenti patogeni a 25 gradi ce…

Representative Results

Utilizzando il protocollo descritto in precedenza, abbiamo ottenuto 0,5–1,0 x 106 ADSC da 5-6 Wnt-1Cre Rosa26topi RFP/z (48 settimane, maschi o femmine). Il diagramma di flusso della raccolta di PAAT da topi è presentato nella Figura 1. La morfologia delle NCADSC era simile all’ADSC da altri tessuti adiposi dei topi. I NCADSC coltivati hanno raggiunto l’80-90% di confluenza dopo 7-8 giorni di cultura, e gli NCADSC hanno avuto un…

Discussion

In questo studio, presentiamo un metodo affidabile per l’isolamento, la cultura e l’induzione adipogenica degli NCADSC estratti dal PVAT di Wnt-1 Cre. Topi transgenici Rosa26RFP/z progettati per la produzione di RFPe ADSC. Le relazioni precedenti mostrano che non vi è alcuna differenza significativa nell’espressione dei marcatori di cellule staminali mesenchymale (MSC) multipotenti in NCADSC e non NCADSC22e che gli NCADSC hanno un forte potenziale per differenziar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

National Key R&D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293), e la Commissione scienza e tecnologia del comune di Shanghai (174111971000, 17140902402) ha fornito i fondi per questo studio .

Materials

4% PFA BBI life sciences E672002-0500 Lot #: EC11FA0001
Agarose ABCONE (China) A47902 1% working concentration
Anti-cebp/α ABclonal A0904 1:1000 working concentration
Anti-mouse IgG, HRP-linked CST 7076 1:5000 working concentration
Anti-perilipin Abcam AB61682 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54
Anti-PPARy SANTA CRUZ sc-7273 0.2 μg/mL working concentration
Anti-rabbit IgG, HRP-linked CST 7074 1:5000 working concentration
Anti-β-Tubulin CST 2146 1:1000 working concentration
BSA VWR life sciences 0332-100G 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008
Collagenase, Type I Gibco 17018029
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902 0.1 µM working concentration
Erythrocyte Lysis Buffer Invitrogen 00-4333
FBS Corning R35-076-CV 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS
HBSS Gibco 14025092
HDMEM Gelifesciences SH30243.01 Lot #: AD20813268
IBMX Sigma-Aldrich I7018 0.5 mM working concentration
Insulin Sigma-Aldrich I3536 1 μg/mL working concentration
Microsurgical forceps Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-F201A-1
Microsurgical scissor Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-H121A
Oil Red O solution Sigma-Aldrich O1516 0.3% working concentration
PBS (Phosphate buffered saline) ABCONE (China) P41970
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PrimeScript RT reagent Kit TAKARA RR047A Lot #: AK4802
RNeasy kit TAKARA 9767 Lot #: AHF1991D
Rosa26RFP/+ mice JAX No.007909 C57BL/6 backgroud; male and female
Rosiglitazone Sigma-Aldrich R2408 1 μM working concentration
Standard forceps Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-F424
Surgical scissor Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-S231
SYBR Premix Ex Taq TAKARA RR420A Lot #: AK9003
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T2877 10 nM working concentration
Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice JAX No.009107 C57BL/6 backgroud; male and female

References

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Qi, Y., Miao, X., Xu, L., Fu, M., Peng, S., Shi, K., Li, J., Ye, M., Li, R. Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (157), e60691, doi:10.3791/60691 (2020).

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