Summary

בידוד, תרבות, והשראה של הרכס העצבי המקורי אדיפוז-תאי גזע שמקורם ברקמת אדיפוז

Published: March 02, 2020
doi:

Summary

אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד, התרבות, והאינדוקציה האדיגנית של הרכס העצבי (NCADSCs) מתוך רקמת השומן של ה-Wnt-1 יצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים. NCADSCs יכול להיות מקור נגיש בקלות של ADSCs עבור מידול אדיפוגנזה או ליפוגנזה ב מבחנה.

Abstract

כמות מוגזמת של רקמת אדיפוז מסביב לכלי הדם (רקמת השומן הפריקולרית, המוכרת גם כ-PVAT), קשורה לסיכון גבוה למחלות לב וכלי דם. ADSCs שמקורם ברקמות שונות מציגות תכונות נפרדות, ואלה מ-PVAT מ לא התאפיין היטב. במחקר שנערך לאחרונה, דיווחו כי חלק ADSCs ברקמת השומן של האבי העורקים (PAAT) לרדת מן התאים ציצה עצבית (NCCs ‘), אוכלוסייה ארעית של תאים נודדים שמקורם האקטועור.

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול עבור בידוד חלבון פלורסנט אדום (RFP) מתויג NCCs מ PAAT של Wnt-1 היצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים וגרימת בידול האדיגניים שלהם בתוך מבחנה. בקצרה, שבר כלי הדם סטרומה (SVF) הוא הושעה אנזימטי של PAAT, ו-RFP+ ציצה עצבית הנגזרת ADSCs (NCADSCs) מבודדים על ידי מיון תא המופעל על ידי הזריחה (facs). NCADSCs להבדיל לתוך שניהם adipocytes חום ולבן, יכול להיות cryopreserved, ולשמור על פוטנציאל האדיגניים שלהם עבור ~ 3 – 5 מעברים. הפרוטוקול שלנו יכול ליצור ADSCs שופע מתוך PVAT ל עבור דוגמנות PVAT ע או ליפוגנזה בתוך מבחנה. לפיכך, NCADSCs אלה יכולים לספק מערכת רבת-ערך לחקר המתגים המולקולריים המעורבים בבידול PVAT מ.

Introduction

השכיחות של השמנת יתר היא גוברת ברחבי העולם, אשר מגביר את הסיכון של מחלות כרוניות קשורות, כולל מחלות לב וכלי דם, סוכרת1. PVAT מ המקיף כלי דם הוא מקור עיקרי של גורמים האנדוקריניים האנדוקרינית המעורבים בפונקציה vascuלטורה. מחקרים קליניים מראים כי תוכן ה-pvat הגבוה הוא גורם סיכון עצמאי של מחלות לב וכלי דם2,3, והפונקציה הפתולוגית שלו תלויה בפנוטיפ של בתאי הגזע שנגזר האדיפוז (ADSCs)4.

למרות הקווים של התאים ADSC כמו murine 3T3-L1, 3T3-F442A, ו OP9 הם מודלים סלולריים שימושיים כדי ללמוד adipogenesis או ליפוגנזה5, מנגנוני הרגולציה של אדיפוגנזה שונים בין קווי התא תאים ראשוניים. ADSCs ב סטרומה תא כלי דם (SVF) מבודד ישירות מרקמות אדיפוז והמושרה להבדיל לתוך adipocytes סביר להניח ביותר בשנת vivo אדיפוגנזה וליפוגנזה6. עם זאת, שבריאת, ציפה, ואת הווריאציות גודל וimmunophenotypes של ADSCs להפוך את הבידוד הישיר שלהם מאתגרת. בנוסף, הליכי הבידוד השונים יכולים גם להשפיע באופן משמעותי על היכולת הפוטנציאלית שלהתאים האלה, ובכךמדגישים את הצורך בפרוטוקול השומר על תקינות adsc.

רקמת אדיפוז מסווגת בדרך כלל כרקמת השומן הלבנה המורפולוגית והפונקציונלית (וואט), או רקמת השומן החום (BAT)8, אשר מנמלים בנפרד ADSCs9. בעוד ADSCs בודד מן הואגונאדאל ומוואטים תת עורית התאפיין במחקרים קודמים9,10,11,12, פחות ידוע לגבי ADSCs מ-pvat כי מורכב בעיקר מבת13.

במחקר שנערך לאחרונה, מצאנו שחלק מADSCs התושב ברקמת השומן של אבי העורקים (paat) נגזרים מתאי ציצה עצבית (nccs ק), אוכלוסייה ארעית של תאים של מהגרים מהגרים שמקורם בעור של14,15. Wnt1-עכברים טרנסגניים שימשו למעקב של מעקב העצבים העצבי תא16,17. חצינו Wnt1-היצורים+ עכברים עם Rosa26rfp/+ עכברים ליצור Wnt-1 היצורים+/-; Rosa26rfp/+ עכברים, שבו nccs ו צאצאיהם מסומנים עם חלבון פלורסנט אדום (rfp) ומסומנים בקלות בvivo ובמבחנה15. כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד ציצה עצבית הנגזרת ADSCs (NC-נגזר ADSCs, או NCADSCs) מהעכבר PAAT ולגרום NCADSCs להבדיל לתוך adipocytes לבן או adipocytes חום.

Protocol

פרוטוקול בעלי החיים נבדק ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ג’יאו טונג שנגחאי. 1. הדור של Wnt-1 היצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים הצלב Wnt-1 היצורים+/- עכברים16 עם Rosa26rfp/+ עכברים18 כדי ליצור wnt-1 יצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכ…

Representative Results

באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, הגענו ~ 0.5 – 1.0 x 106 ADSCs מ 5-6 wnt-1 היצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים (48 בן שבועות, זכר או נקבה). תרשים הזרימה של אוסף PAAT מעכברים מוצג באיור 1. המבנה של הNCADSCs היה דומה ל-ADSC מן העכברים האחרים מרקמות האדיפוז. הNCADSCs התרבותיים הגיעו ל-80…

Discussion

במחקר זה, אנו מציגים שיטה אמינה לבידוד, תרבות, ואינדוקציה אדיפוגניים של NCADSCs שחולצו מ-PVAT של Wnt-1 היצורים+/-; עכברים Rosa26rfp/+ טרנסגניים שתוכננו לייצר rfp+ ADSCs. הדיווחים הקודמים מראים כי אין הבדל משמעותי בביטוי של תאי גזע mesenchymal כללי רב עוצמה (MSCs) סמנים ב NCADSCs ו לא NCADSCs22, ו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

לאומי מפתח R & D תוכנית של סין (2018YFC1312504), הלאומית המדע הטבעי הקרן של סין (81970378, 81670360, 81870293), ועדת המדע והטכנולוגיה של עיריית שנגחאי (17411971000, 17140902402) סיפק את הכספים עבור מחקר זה .

Materials

4% PFA BBI life sciences E672002-0500 Lot #: EC11FA0001
Agarose ABCONE (China) A47902 1% working concentration
Anti-cebp/α ABclonal A0904 1:1000 working concentration
Anti-mouse IgG, HRP-linked CST 7076 1:5000 working concentration
Anti-perilipin Abcam AB61682 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54
Anti-PPARy SANTA CRUZ sc-7273 0.2 μg/mL working concentration
Anti-rabbit IgG, HRP-linked CST 7074 1:5000 working concentration
Anti-β-Tubulin CST 2146 1:1000 working concentration
BSA VWR life sciences 0332-100G 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008
Collagenase, Type I Gibco 17018029
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902 0.1 µM working concentration
Erythrocyte Lysis Buffer Invitrogen 00-4333
FBS Corning R35-076-CV 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS
HBSS Gibco 14025092
HDMEM Gelifesciences SH30243.01 Lot #: AD20813268
IBMX Sigma-Aldrich I7018 0.5 mM working concentration
Insulin Sigma-Aldrich I3536 1 μg/mL working concentration
Microsurgical forceps Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-F201A-1
Microsurgical scissor Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-H121A
Oil Red O solution Sigma-Aldrich O1516 0.3% working concentration
PBS (Phosphate buffered saline) ABCONE (China) P41970
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PrimeScript RT reagent Kit TAKARA RR047A Lot #: AK4802
RNeasy kit TAKARA 9767 Lot #: AHF1991D
Rosa26RFP/+ mice JAX No.007909 C57BL/6 backgroud; male and female
Rosiglitazone Sigma-Aldrich R2408 1 μM working concentration
Standard forceps Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-F424
Surgical scissor Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-S231
SYBR Premix Ex Taq TAKARA RR420A Lot #: AK9003
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T2877 10 nM working concentration
Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice JAX No.009107 C57BL/6 backgroud; male and female

References

  1. Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
  2. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  3. Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).
  4. Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
  5. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
  6. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
  7. Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
  8. Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
  9. Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
  10. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  11. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
  12. Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).
  13. Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
  14. Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
  15. Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
  16. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
  17. Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
  18. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  19. Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).
  20. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  21. Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
  22. Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).
  23. Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
  24. Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).

Play Video

Cite This Article
Qi, Y., Miao, X., Xu, L., Fu, M., Peng, S., Shi, K., Li, J., Ye, M., Li, R. Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (157), e60691, doi:10.3791/60691 (2020).

View Video