JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Farelerde Parazit Virülans değerlendirmek için Leishmania amazonensis ile Vivo Enfeksiyon

Published: February 20, 2020
doi:
10.3791/60617
, , , ,
1Department of Physiology, Institute of Bioscience,University of Sao Paulo

Summary

Burada, Leishmania amazonensisile farelerin kutanöz enfeksiyon değerlendirmek için derlenmiş bir protokol sıyoruz. Bu parazit virülans çalışma için güvenilir bir yöntemdir, enfeksiyona omurgalı konak yanıtı sistemik bir görünüm sağlayan.

Abstract

Leishmania spp. leishmaniases neden protozoan parazitler, kutanöz visseral lezyonlar için klinik bulgular geniş bir yelpazede mevcut hastalıklardır. Şu anda, 12 milyon kişi Leishmania dünya çapında enfekte olduğu tahmin edilmektedir ve 1 milyardan fazla insan enfeksiyon riski altında yaşıyor. Leishmania amazonensis Orta ve Güney Amerika’da endemik ve genellikle doğrudan bir hayvan modelinde görselleştirilmiş olabilir hastalığın kutanöz formuna yol açar. Bu nedenle, L. amazonensis suşları kutanöz leishmaniasis çalışmaları için iyi modeller de kolayca in vitro yetiştirilen çünkü. C57BL/6 fareler insanlarda gözlenen L. amazonensisgüdümlü hastalık ilerlemesini taklit eder ve kutanöz leishmaniasis için en iyi fare suşları modeli olarak kabul edilir. Omurgalı konak, bu parazitler bu hücrelerin savunma mekanizmaları rağmen makrofajlar yaşıyor. Çeşitli çalışmalarda farklı koşullar altında parazit enfekte değerlendirmek için in vitro makrofaj enfeksiyonu testleri kullanın. Ancak, in vitro yaklaşım organizmanın tepkisini göz ardı izole bir hücre sistemi ile sınırlıdır. Burada, konak-parazit etkileşimine sistemik fizyolojik bir bakış sağlayan in vivo murine enfeksiyonu yöntemini derlemekteyiz. L. amazonensis ile C57BL/6 farelerin in vivo enfeksiyonu için ayrıntılı protokol enfektif amastigotlar, fareler ayak takımı kutanöz inokülasyon, lezyon gelişimi ve parazit yük tayini içine parazit farklılaşması nı kapsar. Bu köklü yöntemi, konakçının immün ve metabolik yanıtlarının kutanöz leishmaniasis’e karşı fizyolojik çalışmalar için en uygun yöntem olarak öneriyoruz.

Introduction

Leishmaniases gelişmekte olan ülkelerde önemli sorunları temsil eden dünya çapında yaygın paraziter bulaşıcı hastalıklar ve Dünya Sağlık Örgütü1,2tarafından en önemli ihmal tropikal hastalıklardan biri olarak kabul edilmektedir. Leishmaniases kutanöz ile karakterizedir, mukozal, ve / veya visseral belirtileri. Kutanöz leishmaniasis genellikle L. amazonensisneden olur , L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica ve L. aethiopica3. Hastalığın Bu formu genellikle koruyucu hücresel immün yanıt indüksiyon nedeniyle insanlarda kendi kendine iyileşme olduğunu. Ancak, hücresel immün yanıt başarısız olabilir, ve hastalık yaygın kutanöz leishmaniasis ilerleyebilir4,5. Leishmania türleri ve ev sahibi genetik arka planlar arasında çeşitlilik nedeniyle kullanılabilir bir aşı yoktur6,7. Tedavi seçenekleri de şu anda mevcut ilaçların çoğu ya pahalı, toksik, ve / veya uzun süreli tedavigerektirebilirolarak sınırlıdır 8,9. Ayrıca, mevcut tedavilere karşı ilaç direnci raporları olmuştur10,11.

Leishmaniases ve nedensel ajan protozoon parazit Leishmaniaolduğunu. Parazit yaşam döngüsünde iki farklı morfolojik form sunar: promastigotes, kum sinalarda bulunan kamçılı form; ve amastigotes, memeli konak makrofajlar parasitophorous vakuollerde bulunan hücre içi formu12,13. Amastigotes ‘yeteneği işgal etmek, hayatta kalmak ve omurgalı konak makrofajlar savunma mekanizmaları rağmen çoğaltmak birçokçalışmalaratabidir 14,15,16,17. Sonuç olarak, çeşitli araştırma grupları belirli çevresel faktörlerin yanı sıra parazit ve konak genlerin parazit enfektiliği üzerindeki etkisini değerlendirmek için in vitro makrofaj enfeksiyonu tahlilleri tarif edilmiştir. Bu tahlil, yüksek iş verime biçimine çalışmaları uyarlama yeteneği, sonuç elde etmek için nispeten daha kısa bir süre ve18kurban edilen laboratuvar hayvanı sayısının azalması gibi çeşitli avantajlar sunar. Ancak, in vitro tahlil bulguları her zaman in vivo çalışmalarda çoğaltmak değil çünkü sınırlıdır14,19,20,21. In vivo tahliller tam in vitro tahliller tarafından taklit edilemez konak-parazit etkileşimi, sistemik fizyolojik bir bakış sağlar. Örneğin, immünolojik çalışmalar toplanan footpad doku bölümlerinden immünohistokimyasal tahliller yoluyla ve hatta kurtarılan bağışıklık hücrelerinin analizi için popliteal lenf düğümlerinden yapılabilir22.

Hayvanlar genellikle biyolojik ve biyomedikal araştırmalarda insan hastalıkları için bir model olarak daha iyi hastalıkların altında yatan fizyolojik mekanizmaları anlamak için kullanılır23. Leishmaniasis durumunda, rota, site, veya aşı lama dozu hastalık sonucu etkisi24,25,26,27. Ayrıca, duyarlılık ve insanlar ve farelerde enfeksiyona direnç son derece konak ve parazit genetik arka planlar tarafından düzenlenir4,5,22,28,29,30,31. BALB/ c fareler l. amazonensis kutanöz enfeksiyona son derece duyarlıdır, lenf düğümleri, dalak ve karaciğer 32 parazitlerin yayılması ile hızlı bir hastalık ilerlemesi gösteren32. Hastalık kutanöz metastazlara doğru ilerleyebileceğinden, enfeksiyon ölümcül olabilir. Buna karşılık, C57BL/6 fareler genellikle L. amazonensis enfeksiyonu tahlilleri kalıcı parazit yükleri ile kronik lezyonlar geliştirmek33. Böylece, Bu özel fare türleri ile L. amazonensis enfeksiyon insanlarda kutanöz leishmaniasis kronik formları çalışmak için mükemmel bir model olarak kabul edilmiştir, bu BALB / c fareler enfeksiyon modeli daha iyi hastalık ilerlemesini taklit çünkü5,34.

Bu nedenle, biz in vivo enfeksiyon murine insan hastalığı için geçerli Leishmania virülans fizyolojik çalışmalar için yararlı bir yöntem olduğunu önermek, konak-parazit etkileşimsistemik bir görünüm sağlayan. Iyi kurulmuş tahliller22revisiting , burada axenic amastigotes içine parazit farklılaşması nı oluşturan L. amazonensis ile C57BL/6 farelerin in vivo enfeksiyonu bir derlenmiş adım adım protokol mevcut, fareler ayak takımı kutanöz aşılama, lezyon gelişimi, ve parazit yük tayini. Bu protokol kutanöz leishmaniases neden diğer fare suşları ve Leishmania türlerine adapte edilebilir. Sonuç olarak, burada sunulan yöntem yenianti-Leishmania ilaç hedefleri ve aşıları belirlenmesinde çok önemlidir, yanı sıra leishmania enfeksiyonuna konak bağışıklık ve metabolik tepkiler fizyolojik çalışmalarda.

Protocol

Tüm deneysel prosedürler São Paulo Üniversitesi Biyobilim Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (CEUA 342/2019) ve São Paulo Eyaleti Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı ile ilgili öneriler ve politikalara uygun olarak yürütülmüştür (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) ve Brezilya hükümeti (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Bölüm 1-5’te açıklanan tüm adımlar laminar akış dolaplarıiçinde aseptik olarak yapılmalıdır. Canlı Leishmania</e…

Representative Results

Leishmania protozoan parazitler omurgasız ve omurgalı konaklarında yaşam döngüsü boyunca iki gelişimsel formlarda bulunurlar: promastigotes, dişi kum sineğinin lümeninde bulunan proliferatif formlar; ve amastigotes, memeli konak hücrelerin parasitophorous vakuollerde bulunan proliferatif formları. Promastigotes yaklaşık 1.5 μm genişliğinde ve 20 μm uzunluğunda uzun bir gövdeye sahiptir ve genellikle ön ekstremiteden çıkan bir kamçı vardır. Amastigotes b…

Discussion

Bu protokolde açıklanan in vivo enfeksiyon test sistemik bir senaryoda konak-parazit etkileşimi dikkate alınarak herhangi bir araştırmacı in vivo kutanöz leishmaniasis değerlendirmek için izin verir. Bu tahliller birçok grup tarafından kullanılmıştır22,24,27,29,31,32,34,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

São Paulo Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Enstitüsü Hayvan Merkezi’nden Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara’ya destek için ve Prof. Dr. Silvia Reni Uliana’ya cam doku öğütücüsünü temin ettiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Sao Paulo Araştırma Vakfı (FAPESP – MFLS hibe 2017/23933-3) tarafından desteklenmiştir.

Materials

96-well plate Greiner bio-ne 655180 A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine Sigma A8626 Supplement added to M199 cell culture media
caliper Mitutoyo 700-118-20 A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask Corning 353014 A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge Eppendorf 5804R An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C Thermo Scientific 3110 An incubator for amastigotes differentiation
ethanol Merck K50237083820 A disinfectant for general items
fetal bovine serum Gibco 12657-029 Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube Thomas Scientific 3431 E04 A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose Synth G1008.01.AH Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software GraphPad A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin Sigma H-2250 Supplement added to M199 cell culture media
HEPES Promega H5303 Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C Fanem 347CD An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope Nikon TMS An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet Veco VLFS-09 A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media Gibco 31100-035 A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube Axygen MCT150C A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette Labsystems F61978 A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3 Merck 6329 Supplement added to M199 cell culture media
NaOH Sigma S8045 Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber HBG 2266 A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope Nikon E200 An optical equipament used to count parasite
parafilm Bemis 349 A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes TPP 93100 A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit Gilson F167360 A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale Quimis BG2000 An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel Solidor 10237580026 A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL Nest 327001 A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips Axygen A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue Gibco 15250-061 A dye used to count viable parasites
trypticase peptone Merck Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe BD 305945 A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PloS One. 7 (5), e35671 (2012).
  2. Ashford, R. W. The leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. International Journal for Parasitololy. 30 (12-13), 1269-1281 (2000).
  3. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  4. Scorza, B. M., Carvalho, E. M., Wilson, M. E. Cutaneous Manifestations of Human and Murine Leishmaniasis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), e1296 (2017).
  5. Afonso, L. C., Scott, P. Immune responses associated with susceptibility of C57BL/10 mice to Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 61 (7), 2952-2959 (1993).
  6. Khamesipour, A., Rafati, S., Davoudi, N., Maboudi, F., Modabber, F. Leishmaniasis vaccine candidates for development: a global overview. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 423-438 (2006).
  7. Kumar, R., Engwerda, C. Vaccines to prevent leishmaniasis. Clinical & Translational Immunology. 3 (3), e13 (2014).
  8. Murray, H. W., Berman, J. D., Davies, C. R., Saravia, N. G. Advances in leishmaniasis. Lancet. 366 (9496), 1561-1577 (2005).
  9. Hotez, P. J., Bottazzi, M. E., Franco-Paredes, C., Ault, S. K., Periago, M. R. The neglected tropical diseases of Latin America and the Caribbean: a review of disease burden and distribution and a roadmap for control and elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2 (9), e300 (2008).
  10. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clinical Microbiology Reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
  11. Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
  12. Teixeira, D. E., et al. The cell biology of Leishmania: how to teach using animations. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003594 (2013).
  13. Sunter, J., Gull, K. Shape, form, function and Leishmania pathogenicity: from textbook descriptions to biological understanding. Open Biology Journal. 7 (9), 170165 (2017).
  14. Laranjeira-Silva, M. F., et al. A MFS-like plasma membrane transporter required for Leishmania virulence protects the parasites from iron toxicity. PLoS Pathogens. 14 (6), e1007140 (2018).
  15. Aoki, J. I., et al. L-arginine availability and arginase activity: Characterization of amino acid permease 3 in Leishmania amazonensis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006025 (2017).
  16. Probst, C. M., et al. A comparison of two distinct murine macrophage gene expression profiles in response to Leishmania amazonensis infection. BMC Microbiology. 12, 22 (2012).
  17. Dillon, L. A., et al. Simultaneous transcriptional profiling of Leishmania major and its murine macrophage host cell reveals insights into host-pathogen interactions. BMC Genomics. 16, 1108 (2015).
  18. Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. Journal of Visualized Experiments. (133), e57486 (2018).
  19. Mittra, B., Laranjeira-Silva, M. F., Miguel, D. C., Perrone Bezerra de Menezes, J., Andrews, N. W. The iron-dependent mitochondrial superoxide dismutase SODA promotes. The Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12324-12338 (2017).
  20. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 ferric iron reductase of Leishmania amazonensis is essential for the generation of infective parasite forms. The Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  21. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PloS One. 7 (3), e34022 (2012).
  22. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Current Protocols in Immunology. , (1998).
  23. Andersen, M. L., Winter, L. M. F. Animal models in biological and biomedical research – experimental and ethical concerns. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91, e20170238 (2019).
  24. Ribeiro-Gomes, F. L., et al. Site-dependent recruitment of inflammatory cells determines the effective dose of Leishmania major. Infection and Immunity. 82 (7), 2713-2727 (2014).
  25. Mahmoudzadeh-Niknam, H., Khalili, G., Abrishami, F., Najafy, A., Khaze, V. The route of Leishmania tropica infection determines disease outcome and protection against Leishmania major in BALB/c mice. The Korean Journal of Parasitology. 51 (1), 69-74 (2013).
  26. Oliveira, D. M., et al. Evaluation of parasitological and immunological parameters of Leishmania chagasi infection in BALB/c mice using different doses and routes of inoculation of parasites. Parasitology Research. 110 (3), 1277-1285 (2012).
  27. Côrtes, D. F., et al. Low and high-dose intradermal infection with Leishmania major and Leishmania amazonensis in C57BL/6 mice. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 105 (6), 736-745 (2010).
  28. Blackwell, J. M., et al. Genetics and visceral leishmaniasis: of mice and man. Parasite Immunology. 31 (5), 254-266 (2009).
  29. Loeuillet, C., Bañuls, A. L., Hide, M. Study of Leishmania pathogenesis in mice: experimental considerations. Parasites & Vectors. 9, 144 (2016).
  30. Alexander, J., Brombacher, F. T Helper1/T Helper2 Cells and Resistance/Susceptibility to Leishmania Infection: Is This Paradigm Still Relevant?. Frontiers in Immunology. 3, 80 (2012).
  31. Sacks, D., Noben-Trauth, N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice. Nature Reviews Immunology. 2 (11), 845-858 (2002).
  32. Bogdan, C., et al. Experimental Cutaneous Leishmaniasis: Mouse Models for Resolution of Inflammation Versus Chronicity of Disease. Methods in Molecular Biology. 1971, 315-349 (2019).
  33. Jones, D. E., Ackermann, M. R., Wille, U., Hunter, C. A., Scott, P. Early enhanced Th1 response after Leishmania amazonensis infection of C57BL/6 interleukin-10-deficient mice does not lead to resolution of infection. Infection and Immunity. 70 (4), 2151-2158 (2002).
  34. Velasquez, L. G., et al. Distinct courses of infection with Leishmania (L.) amazonensis are observed in BALB/c, BALB/c nude and C57BL/6 mice. Parasitology. 143 (6), 692-703 (2016).
  35. de Menezes, J. P., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), 1266 (2017).
  36. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005340 (2016).
  37. Zilberstein, D., Nitzan Koren, R. Host-Free Systems for Differentiation of Axenic Leishmania. Methods in Molecular Biology. 1971, 1-8 (2019).
  38. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annual Review of Microbiology. 48, 449-470 (1994).
  39. Dumetz, F., et al. Modulation of Aneuploidy in Leishmania donovani during adaptation to different in vitro and in vivo environments and its impact on gene expression. MBio. 8 (3), e00599-e00517 (2017).
  40. Sinha, R., et al. Genome Plasticity in Cultured Leishmania donovani: Comparison of Early and Late Passages. Frontiers in Microbiology. 9, 1279 (2018).
  41. Magalhães, R. D., et al. Identification of differentially expressed proteins from Leishmania amazonensis associated with the loss of virulence of the parasites. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (4), e2764 (2014).
  42. Lei, S. M., Romine, N. M., Beetham, J. K. Population changes in Leishmania chagasi promastigote developmental stages due to serial passage. Journal of Parasitology. 96 (6), 1134-1138 (2010).
  43. Ali, K. S., Rees, R. C., Terrell-Nield, C., Ali, S. A. Virulence loss and amastigote transformation failure determine host cell responses to Leishmania mexicana. Parasite Immunology. 35 (12), 441-456 (2013).
  44. Rebello, K. M., et al. Leishmania (Viannia) braziliensis: influence of successive in vitro cultivation on the expression of promastigote proteinases. Experimental Parasitology. 126 (4), 570-576 (2010).
  45. Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunology. 7 (5), 545-555 (1985).
  46. Lima, H. C., Bleyenberg, J. A., Titus, R. G. A simple method for quantifying Leishmania in tissues of infected animals. Parasitology Today. 13 (2), 80-82 (1997).
  47. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (1997).
  48. Sacks, D., Kamhawi, S. Molecular aspects of parasite-vector and vector-host interactions in leishmaniasis. Annual Review of Microbiology. 55, 453-483 (2001).
  49. Reimão, J. Q., et al. Parasite burden in Leishmania (Leishmania) amazonensis-infected mice: validation of luciferase as a quantitative tool. Journal of Microbiological Methods. 93 (2), 95-101 (2013).
  50. Buckley, S. M., et al. In vivo bioimaging with tissue-specific transcription factor activated luciferase reporters. Scientific Reports. 5, 11842 (2015).
  51. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. Journal of Visualized Experiments. (41), e1980 (2010).
  52. Roberts, S. C., et al. Arginase plays a pivotal role in polyamine precursor metabolism in Leishmania. Characterization of gene deletion mutants. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23668-23678 (2004).
  53. Boitz, J. M., et al. Arginase Is Essential for Survival of Leishmania donovani Promastigotes but Not Intracellular Amastigotes. Infection and Immunity. 85 (1), e00554 (2017).
  54. Rosas, L. E., et al. Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice. International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).
  55. Belkaid, Y., et al. Development of a natural model of cutaneous leishmaniasis: powerful effects of vector saliva and saliva preexposure on the long-term outcome of Leishmania major infection in the mouse ear dermis. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1941-1953 (1998).
  56. Titus, R. G., Ribeiro, J. M. Salivary gland lysates from the sand fly Lutzomyia longipalpis enhance Leishmania infectivity. Science. 239 (4845), 1306-1308 (1988).
  57. Lima, H. C., Titus, R. G. Effects of sand fly vector saliva on development of cutaneous lesions and the immune response to Leishmania braziliensis in BALB/c mice. Infection and Immunity. 64 (12), 5442-5445 (1996).
  58. Theodos, C. M., Ribeiro, J. M., Titus, R. G. Analysis of enhancing effect of sand fly saliva on Leishmania infection in mice. Infection and Immunity. 59 (5), 1592-1598 (1991).
  59. Kaur, S., et al. Effect of dose and route of inoculation on the generation of CD4+ Th1/Th2 type of immune response in murine visceral leishmaniasis. Parasitology Research. 103 (6), 1413-1419 (2008).
  60. Rolão, N., Melo, C., Campino, L. Influence of the inoculation route in BALB/c mice infected by Leishmania infantum. Acta Tropica. 90 (1), 123-126 (2004).
  61. Kébaïer, C., Louzir, H., Chenik, M., Ben Salah, A., Dellagi, K. Heterogeneity of wild Leishmania major isolates in experimental murine pathogenicity and specific immune response. Infection and Immunity. 69 (8), 4906-4915 (2001).
  62. Baldwin, T. M., Elso, C., Curtis, J., Buckingham, L., Handman, E. The site of Leishmania major infection determines disease severity and immune responses. Infection and Immunity. 71 (12), 6830-6834 (2003).
  63. Aoki, J. I., et al. RNA-seq transcriptional profiling of Leishmania amazonensis reveals an arginase-dependent gene expression regulation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006026 (2017).
  64. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. International Journal for Parasitology. 35 (7), 757-764 (2005).
  65. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Experimental Parasitology. 99 (2), 97-103 (2001).
  66. Aoki, J. I., Laranjeira-Silva, M. F., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M. The impact of arginase activity on virulence factors of Leishmania amazonensis. Current Opinion in Microbiology. 52, 110-115 (2019).
  67. Jackson, A. P. The evolution of amastin surface glycoproteins in trypanosomatid parasites. Molecular Biology and Evolution. 27 (1), 33-45 (2010).
  68. Rochette, A., et al. Characterization and developmental gene regulation of a large gene family encoding amastin surface proteins in Leishmania spp. Molecular and Biochemical Parasitology. 140 (2), 205-220 (2005).
  69. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  70. Schneider, P., Rosat, J. P., Bouvier, J., Louis, J., Bordier, C. Leishmania major: differential regulation of the surface metalloprotease in amastigote and promastigote stages. Experimental Parasitology. 75 (2), 196-206 (1992).
  71. Ji, J., Sun, J., Qi, H., Soong, L. Analysis of T helper cell responses during infection with Leishmania amazonensis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 66 (4), 338-345 (2002).
  72. Ji, J., Sun, J., Soong, L. Impaired expression of inflammatory cytokines and chemokines at early stages of infection with Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 71 (8), 4278-4288 (2003).
  73. Felizardo, T. C., Toma, L. S., Borges, N. B., Lima, G. M., Abrahamsohn, I. A. Leishmania (Leishmania) amazonensis infection and dissemination in mice inoculated with stationary-phase or with purified metacyclic promastigotes. Parasitology. 134 (12), 1699-1707 (2007).
  74. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M., Markus, R. P. Melatonin attenuates Leishmania (L.) amazonensis infection by modulating arginine metabolism. Journal of Pineal Research. 59 (4), 478-487 (2015).

Tags

Leishmania AmazonensisIn Vivo InfectionVirulenceCutaneous LeishmaniasisMouse ModelPromastigotesAmastigotesSubplantar InjectionLesion ProgressionParasite Quantification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R. A., Floeter-Winter, L. M., Laranjeira-Silva, M. F. In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice. J. Vis. Exp. (156), e60617, doi:10.3791/60617 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image