Viral poliproteine gömülü homolog konak-patojen protein dizilerinin (SSHHPS) kısa uzantılarını belirlemek için genel bir protokol sayılmiyoruz. SSHHPS viral proteazlar tarafından tanınan ve çeşitli Grup IV virüsler tarafından belirli konak proteinlerin hedefli imha doğrudan.
Alfaviral enzimler tek bir polipeptit içinde sentezlenir. Yapısal olmayan poliprotein (nsP) viral replikasyon için gerekli aktif enzimler üretmek için onun nsP2 sistein proteaz tarafından işlenir. Viral proteazlar son derece spesifiktir ve korunmuş dekolte yeri motif dizilerini tanırlar (~6-8 amino asitler). Bazı Grup IV virüslerinde, nsP proteaz(lar) dekolte yeri motif dizileri doğuştan gelen immün yanıtların oluşmasında rol oynayan belirli konak proteinlerde bulunabilir ve bazı durumlarda hedeflenen proteinler virüse bağlı fenotipile bağlantılı görünür. Bu virüsler, konak proteinlerin hedefli imhası için homolog konak-patojen protein dizilerinin (SSHHPS) kısa uzantılarını kullanırlar. SSHHPS’i tanımlamak için viral proteaz dekolte sit motif dizileri BLAST’a girilebilir ve konak genom(lar) aranabilir. Dekolte başlangıçta saflaştırılmış nsP viral proteaz ve floresan rezonans enerji transferi (FRET) substratları E. coliyapılan kullanılarak test edilebilir. FRET yüzeyleri siyan ve sarı floresan protein ve dekolte alanı dizisi (CFP-sequence-YFP) içerir. Bu proteaz tsay sürekli bir plaka okuyucu veya sds-PAGE jelleri sürekli olarak kullanılabilir. Bağlı peptid substrat modelleri substrat seçimi ve mutagenez çalışmaları rehberlik silico oluşturulabilir. CFP/YFP substratları da proteaz inhibitörlerini tanımlamak için kullanılmıştır. Bu in vitro ve in silico yöntemleri, hedeflenen konak proteininin viral replikasyonu etkileyip etkilemediğini belirlemek için hücre bazlı tahlillerle birlikte kullanılabilir.
Virüsten konakveya virüse ev sahipliği yapmak için yatay gen transferi kanıtı, çeşitli genomlarda bulunabilir1,2,3,4. Viral endojenizasyona örnek olarak bakteriyel konak genomlarında bulunan CRISPR spacer dizileri4. Son zamanlarda,(+)ssRNA Grup IV virüslerinin yapısal olmayan poliproteinlerine gömülü konak protein dizilerinin kanıtlarını bulduk. Viral genomun kodlama bölgelerindeki bu diziler nesilsel olarak yayılabilir. Homolog konak-patojen protein dizilerinin (SSHHPS) kısa uzantıları virüste bulunur ve5,6. SSHHPS, spesifik konak proteinlere homolojisi olan viral proteazlar tarafından tanınan korunmuş dekolte yeri motif dizileridir. Bu diziler belirli konak proteinlerinin yok oluşuna yönlendirir.
Bir önceki yayınımızda6,viral proteazlar tarafından hedeflenen tüm konak proteinlerin bir listesini derledik ve hedef listesinin rastgele olmadığını tespit ettik(Tablo 1). İki eğilim belirgindi. İlk olarak, konak proteinleri kesen viral proteazların çoğu Grup IV virüslere (24’ü Grup IV viral proteazlar dahil 25 vakadan 24’ü) ve bir proteaz (+)ssRNA Group VI retroviruses (HIV, insan immün yetmezlik virüsü)7’yeaitti. İkinci olarak, viral proteazlar tarafından kesilen konak protein hedefleri genellikle dekoltelerin konakçının bağışıklık yanıtlarını antagonize etmek için tasarlandığını düşündüren doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarının oluşmasında rol almıştır. Viral proteazların hedef açtığı konak proteinlerin yarısı interferon (IFN) ve proinflamatuar sitokinler üreten sinyal basamaklarının bilinen bileşenleridir(Tablo 1). Diğerleri ev sahibi hücre transkripsiyon8,9,10 veya çeviri11dahil edildi. İlginçtir, Shmakov ve ark.4 birçok CRISPR protospacer dizileri plazmid konjugasyon veya çoğaltma4dahil genlere karşılık olduğunu göstermiştir.
Grup IV, diğerleri arasında, Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae ve Togaviridaeiçerir. Zika virüsü (ZIKV), Batı Nil (WNV), Chikungunya (CHIKV), şiddetli akut solunum sendromu virüsü (SARS) ve Orta Doğu solunum sendromu virüsü (MERS) gibi birçok yeni ve yeni ortaya çıkan patojen Grup IV’e aittir. (+)ssRNA genomu aslında bir mRNA parçasıdır. Genom replikasyonu için gerekli enzimleri üretmek için önce (+)ssRNA genomu tercüme edilmelidir. Alfavirüsler ve diğer Grup IV virüslerde, replikasyon için gerekli enzimler tek bir poliproteinde (yani VEEV için nsP1234) üretilir. Yapısal olmayan poliprotein (nsP) proteolyically işlenir (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) nsP2 proteaz tarafından aktif enzimler üretmek için12 (Şekil 1). NsP2 proteaz ile poliprotein bölünmesi viral çoğaltma için gereklidir; bu nsP2 proteaz13,14aktif site sistein delemesi ve site yönelimli mutagenez ile gösterilmiştir. Özellikle, viral proteinlerin çevirisi genom replikasyon olaylarından önce gelir. Örneğin, nsP4 (+)ssRNA genomunu çoğaltmak için gereken RNA’ya bağımlı RNA polimeraz içerir. Genom replikasyonu dsRNA ara üretebilir; bu ara lar konakçının doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını tetikleyebilir. Böylece, Bu virüsler etkilerini bastırmak için enfeksiyon erken konak doğuştan gelen bağışıklık yanıtı proteinleri cleave olabilir15,16,17.
Susturma DNA, RNA ve protein düzeyinde oluşabilir. Şekil 1’de gösterilen susturma mekanizmalarının her birinde yaygın olan şey, işlevlerini antagonize etmek için belirli hedeflerin yok edilmesine rehberlik etmek için kısa yabancı DNA, RNA veya protein dizilerinin kullanılmasıdır. Susturma mekanizmaları, üç farklı dilde yazılmış “arama ve silme” programlarına benzerdir. Kısa dekolte site sırası bir “anahtar kelime” benzer. Her program kısa sıra (“anahtar kelime”) ve silinecek olan “dosya” bir kelime arasındaki eşleşmeyi tanıyan bir enzim vardır. Bir eşleşme bulunduğunda, enzim daha büyük hedef sırasını keser (“siler”). Şekil 1’de gösterilen üç mekanizma, konakçıyı virüslerden korumak veya bir virüsü bir ev sahibinin bağışıklık sisteminden korumak için kullanılır.
Viral proteazlar ~ 2-11 amino asitler arasında kısa bölünme site motif dizileri tanımak; nükleotitlerde bu 6-33 baza karşılık gelir. Karşılaştırma için, CRISPR spacer dizileri ~ 26-72 nükleotit ve RNAi ~ 20-22 nükleotitler18,19vardır. Bu diziler nispeten kısa olsa da, özellikle tanınabilir. Amino asitlerin yüksek çeşitliliği göz önüne alındığında, rastgele bir bölünme olayı olasılığı nispeten düşük bir viral proteaz 6-8 amino asit veya daha uzun protein dizileri tanıyan için. Konak proteinlerde SSHHPS’nin tahmini büyük ölçüde incelenen viral proteazın özgüllüğüne bağlıdır. Proteaz ın kesin dizi özgüllük gereksinimleri varsa, dekolte site dizisi bulma şansı 1/206 = 1 64 milyonda veya 1/208 = 1’dir 25,6 milyarda; ancak proteazların çoğunda değişken alt alan toleransları vardır (örneğin, R veya K S1 bölgesinde tolere edilebilir). Sonuç olarak, ana bilgisayarda bulunan diziler ile virüs arasında dizi kimliği gereksinimi yoktur. Daha gevşek dizi gereksinimleri olan viral proteazlar için (Picornaviridae’ye ait olanlar gibi) bir konak proteinde dekolte bölgesi bulma olasılığı daha yüksek olabilir. Tablo 1’deki girişlerin çoğu Picornaviridae ailesindendir.
Schechter & Bergergösterimi 20 yaygın bir proteaz substrat ve onlar bağlamak alt siteleri kalıntılar tanımlamak için kullanılır, biz boyunca bu gösterim kullanmak. Makas bağının N-terminali olan substrattaki kalıntılar P3-P2-P1 olarak gösterilirken, C-terminali olanlar P1′-P2′-P3′ olarak gösterilir. Bu amino asit kalıntıları bağlamak proteaz karşılık gelen alt siteleri Sırasıyla S3-S2-S1 ve S1′-S2′-S3′, vardır.
Hangi ana proteinlerin hedeflendiğini belirlemek için viral poliprotein bölünme bölgelerindeki SSHHPS’yi belirleyebilir ve bunları içeren konak proteinleri arayabiliyoruz. Burada, bilinen viral proteaz dekolte site dizilerini kullanarak SSHHPS’nin tanımlanmasına yönelik prosedürleri ana hatlar. Biyoinformatik yöntemler, proteaz testleri ve tanımlanan silico metodlarında hücre bazlı tahlillerle birlikte kullanılması amaçlanmıştır.
Viral proteazların hedef açtığı konak proteinlerin dizi dizileri bu kısa bölünme alanı dizileri içinde türe özgü farklılıklar ortaya koymuştur. Örneğin, Venezuela at ensefaliti virüsü (VEEV) nsP2 proteaz insan TRIM14, üçlü motif (TRIM) protein6kesmek bulundu. Bazı TRIM proteinleri viral restriksiyon faktörleridir (örneğin, TRIM5α21),çoğu ubiquitin E3 ligazları olduğu düşünülmektedir. TRIM14 bir RING yoksun (gerçekten ilginç yeni gen) etki alanı ve bir E3 ligase olduğu düşünülmemaktadır22. TRIM14 mitokondriyal antiviral sinyalozom bir adaptör olduğu ileri sürülmuştur (MAVS)22, ancak diğer antiviral fonksiyonları olabilir23. Trim14 dizilerinin çeşitli türlerden hizalanması, atların dekolte alanından yoksun olduğunu ve C-terminal PRY/SPRY etki alanını eksik olan TRIM14’ün kesilmiş bir sürümünü barındırdığını göstermektedir. Bu etki alanı bir poliubiquitination sitesi içerir (Şekil 2). At, bu virüsler son derece ölümcül (~ 20-80% mortalite) insanlarda ise sadece ~ 1% VEEV enfeksiyonları24ölür. PRY/SPRY etki alanının bölünmesi, MAVS sinyalajı basamaklama da geçici olarak kısa devre yapabilir. Bu basamak dsRNA tarafından tetiklenebilir ve interferon ve pro-inflamatuar sitokinüretimine yol açar. Bu nedenle, SSHHPS varlığı belirli Grup IV virüslere karşı hangi türlerin savunma sistemleri olduğunu tahmin etmek için yararlı olabilir.
Grup IV virüslerde IFN antagonizm mekanizmalarının25’içarpın. Konak protein bölünmesi enfeksiyon sırasında geçici olabilir ve konsantrasyonlar zamanla düzelebilir. Hücrelerde TRIM14 dekolte ürünlerinin transfeksiyondan sonra çok erken tespit edilebildiğini (6 saat) proteazı (sitomegalovirüs organizatörü) kodlayan bir plazmid ile bulduk. Ancak, daha uzun sürelerde, dekolte ürünleri tespit edilmedi. Virüs enfekte hücrelerde kinetik ler farklıydı ve dekolte ürünleri 6-48 h6arasında tespit edilebilir. Diğerleri erken 3-6 h sonrası enfeksiyon9,11gibi erken konak protein dekolte ürünlerinin görünümünü bildirdin.
Hücrelerde proteolitik aktivite genellikle yakalamak zordur; dekolte ürünleri çözünürlüğü, konsantrasyonu, stabilitesi ve kullanım ömrü açısından değişebilir. Hücre bazlı tahlillerde, dekolte ürünlerinin bir hücrede birikeceği veya kesilen ve kesilmemiş proteinin bant yoğunluklarının kompansatuar artışlar göstereceği ve kesilen proteinin çok hızlı bir şekilde bozulabileceği ve beklenen molekül ağırlığında (MW) batı lekesinde tespit edilemeyeceği varsayılamaz (örneğin, epite içeren bölge diğer konakçı proteasesveya bedide verilebilir). Viral proteaz substrat doğuştan gelen bir bağışıklık yanıtı proteiniseniz, konsantrasyonu enfeksiyon sırasında değişebilir. Örneğin, bazı doğuştan gelen immün yanıt proteinleri viral enfeksiyon öncesinde mevcut ve interferon tarafından daha fazla indüklenen26. Bu nedenle hedef proteinin konsantrasyonu enfeksiyon sırasında dalgalanabilir ve enfekte olmayan hücre lisatlarının karşılaştırılması zor olabilir. Ayrıca, tüm hücreler düzgün transfected veya enfekte olmayabilir. Öte yandan E. coli saflaştırılmış proteinler kullanılarak in vitro proteaz tahlilleri kontrol etmek için daha az değişken var ve bu tür tahliller immünoblots yerine SDS-PAGE kullanılarak yapılabilir. Kontamine proteazlar CFP /YFP substrat protein saflaştırma erken aşamalarında inhibe edilebilir, ve mutasyona uğramış viral proteazlar saflaştırılmış ve dekolte viral proteaz veya kontamine bakteriyel proteaz nedeniyle olup olmadığını belirlemek için kontrol olarak test edilebilir.
In vitro proteaz tahlillerinin bir sınırlaması, bir memeli hücresinin karmaşıklığından yoksun olmalarıdır. Bir enzimin substratını kesmesi için ikisinin birlikte lokalize olması gerekir. Grup IV viral proteazlar yapı ve lokalizasyon açısından farklılık gösterir. Örneğin, ZIKV proteazendilazmik retikulum gömülü ve sitosol yüzleri, VEEV nsP2 proteaz sitoplazma ve çekirdek27çözünür bir protein ise . ZIKV SSHHPS analizinde bulunan bazı dekolte site dizileri sinyal peptidlerinde olup dekoltenin bazı hedefler için birlikte çevrim selamiyet olabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle bu analizlerde proteazın ve hücredeki substratların yeri de göz önünde bulundurulmalıdır.
Hücre bazlı tahliller, enfeksiyonda tanımlanan konak protein(ler) için bir rol oluşturmak için değerli olabilir. Konak proteinlerin viral proteaz dekoltesini durdurmayı amaçlayan yöntemler, örneğin proteaz inhibitörü6 veya konak hedef16’da mutasyon gibi viral çoğalma üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir. Hedeflenen proteinin aşırı ekspresyonu da viral replikasyonu etkileyebilir28. Plak tahlilleri veya diğer yöntemler viral replikasyon ölçmek için kullanılabilir.
Bir proteinin veya yabancı bir dizinin yönlendirilen nükleik asitin diziye özgü yıkımı biyolojide sadece birkaç vakada görülür. Şekil 1’de gösterilen mekanizmalar, bir ana bilgisayarı virüsten veya bir virüsten koruyan savunma mekanizmalarıdır.
Biyoinformatik yöntemleri kullanarak bu sistemler tarafından yok edilen hedefleri belirleyebiliriz. SSHHP dizileri üzerinde yaptığımız analizlerde, bunların çoğunun doğuştan gelen bağışıklık yanıtları üretmek için gerekli proteinlerde bulunabileceğini keşfettik. Bazı MAVS ve TRIF (TIR-etki alanı içeren adaptör-interferon-β indükleyici) gibi bariz rolleri vardı, diğerleri daha karmaşık mekanizmalar olsa bağışıklık ile ilgili iken (örneğin, Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. SSHHP dizisinde depolanan hedef bilgiler, bu virüslere karşı antiviral etkiye sahip yolları belirleme potansiyeline sahiptir. Vivo antiviral yanıtlar genellikle virüse özgü26,43. Örneğin, TRIM proteinlerinin alt kümelerinin farklı virüsler üzerinde antiviral etkileri vardır43,44,45, bazıları viral kısıtlama faktörleridir (örneğin, HIV ve TRIM5α). TRIM proteinlerinin özgüllüğü (~70 tespit edilmiştir) halen44,45incelenmektedir. SSHHPS içindeki bilgiler, bu virüslerin doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarından nasıl kaçtığını anlamamıza katkıda bulunabilir. Daha fazla SSHHPS incelendiğinde diğer desenler ve korelasyonlar ortaya çıkarılabilir.
Analizlerimizde türe özgü farklılıklar belirgindi(Şekil 2, Şekil 10). Bu virüslerin bazı türleri diğerlerinden daha fazla etkilediği bilinmektedir. SSHHPS’de ana bilgisayar aralığı, ana bilgisayar duyarlılığı ve ev sahibi savunması hakkında bilgiler bulunabilir. Örneğin, at ensefalit iliklerine en yatkın türler olan at, VEEV nsP2 proteazı tarafından geçici olarak kesilen insan TRIM14 bölgesinden yoksundu. İnsanlar nadiren VEEV enfeksiyonlarından ölürler ancak24enfeksiyon kapılabilir. İnsan TRIM14 protein bir nsP2 proteaz dekolte dizisi6taşıdı. Dekolte alanının varlığı insanların bu virüslere karşı bir savunma mekanizması olduğunu göstermektedir. Kuşlar bu virüslerin potansiyel rezervuarları olduğu düşünülmektedir46. TRIM14 proteinindeki karşılık gelen SSHHP dizisi tavuklardan insanlarda ve diğer türlerde bulunan dizilerden farklıydı. Bu gibi ince farklılıklar bir hedef konak protein amcaavable veya daha kolay cleaved yapabilir. Aguirre ve ark.16 bir amcaavable mutasyona uğramış STRING protein Dang virüs enfeksiyonu sonra IFN yüksek düzeyde indüklenen ve fareler doğal Olarak Dang ns2B3 proteaz tarafından kesilmez STING bir sürümünü taşımak gösterdi. Murine STING proteini ZIKV proteaz47tarafından kesilmedi. SSHHPS analizimizde, zikv proteaz bölünme alanı dizilerinde insan proteinlerini kemirgen6(Şekil 10 D)ile karşılaştırdığımızda farklılıklar gözlemledik. Grup IV virüsleriçin kullanılan hayvan modellerinde konak proteinlerin türlerine özgü proteolitik dekoltelerinin çoğaltılması önemli olabilir. Konak protein bölünmesiinin inhibisyonu da Grup IV proteaz inhibitörlerinin gelişimi ile ilgili etkileri vardır. Bir önceki yayınımızda, CA074 metil ester6kullanarak VEEV nsP2 proteazı ile TRIM14 dekoltesini inhibe edebileceğimizi gösterdik. Bu sonuç, bu proteazların küçük molekül inhibitörleri enfeksiyonu bastırma yeteneğine sahip doğuştan gelen bağışıklık yanıtları modüle etmek mümkün olabileceğini düşündürmektedir6,31.
Bir tür içindeki genetik varyasyon da proteolitik bölünme farklılıkları üretmek için potansiyele sahiptir. Kodon kullanımındaki ince farklılıklar ribozom duraklamaetkileyebilir 48. Bazı Grup IV viral proteazlar ER membranına gömülü olduğundan, bölünme eş-çeviri selami oluşursa bu duraklamalarda farklılıklar hedefin bölünmesini etkileyebilir. Tespit ettiğimiz dekolte bölgelerinin bazıları tahmin edilen sinyal peptid dizilerinde (örn. SFRP1) iken diğerleri dahiliidi.
SSHHPS analizi, diğer konak protein analiz yöntemlerinden farklı bilgiler üretebilir. SSHHPS analizi ucuz ve kullanımı kolaydı. Bakteriyel ekspresyon sisteminin kullanılması, memeli hücre kültürünü kullanmadan memeli dizilerinin kısa segmentlerinin (~25 amino asitleri) test edilmesine olanak sağladı. CFP-YFP substratlarının test edilen tüm insan protein dizilerine tahammül edebildiğini bulduk; ancak, verimleri çeşitlidir. Benzer tahlillerde, 63 amino asit kadar insan protein dizileri içeren substratlar başarıyla ifade edildi, saflaştırılmış, ve kinetik analizler ve inhibitör tarama için kullanılan49,50,51. Kesintili titrek için sadece küçük miktarlarda substrat gerektiğinden, çok sayıda hedef araştırılabilir. Sistemin bir avantajı CFP /YFP yüzeyleri SDS-PAGE analizleri ve daha ayrıntılı kinetik analizler için kullanılabilir (yani, IC50, Ki, Km, Vmax). İlaç keşfi için, inhibitör bileşikler floresan tahliller eserler üretebilir. Böylece, sürekli bir test ile birlikte sürekli test bir dekolte veya dekolte inhibisyonu onaylamak için izin verir. Kesintili SDS-PAGE teşrisi örnekleri doğrudan 96 kuyulu plakalardan alınabilir. CFP/YFP yüzeyleri bileşik kütüphane taraması için kullanılmıştır52. Ancak, bir alt tabakazın Z-faktör53’ünhesaplanması gibi yüksek iş elde taraması için uygun olup olmadığını belirlemek için ek analizler gereklidir.
Bir substrat tasarımında bir sorun bağlı ve proteaz tarafından tanınan makas bağ etrafında bölge tespit etmektir. Burada gösterilen örneklerde, makas bağı etrafında ortalanmış 12 kalıntı dizisi ile başladık. Veev proteazı için dekolte bölgelerinin homolojisi kalıntılarına homolojinin dizi hizalamaları analiz edildikten sonra, ZIKV proteaz homolojisinde ise C-terminal kalıntılarının bir çoğuna rastlandı. Kenetlenmiş substrat bir silico modeli substrat bağlayıcı siteleri araştırmak site yönettiği mutagenez deneyleri tasarlamak için kullanılabilir. Substrat ve enzim dizileri plazmidler üzerinde olduğundan, silico modellerinde veya alt sektör toleranslarında test etmek için mutasyona uğrayabilir. Bağlı substrat(lar)ın kristal yapısı mevcut değilse bu avantajlı olabilir.
SSHHPS analizi, virüse bağlı fenotiplerin viral enzimler tarafından üretilme mekanizmaları hakkında da yeni bilgiler verebilir. ZikV hedeflerinden biri, SFRP1, Wnt sinyal yolunun bir parçasıdır ve beyin ve göz gelişiminde ve bağışıklık yanıtlarında rolleri vardır36,37,54,55,56,57. ZIKV ns2B/ns3 proteazı ile kesilebilen diğer protein dizilerinin beyin ve göz gelişiminde yer alan proteinlerde de bulunduğunu bulduk; her ikisinde de konjenital Zika sendromunda anormallikler gözlenmiştir ve virüse bağlı fenotip58’inbir parçası olduğu düşünülmektedir.
Konak-patojen etkileşimlerinin öngörülebilirliği çeşitli uygulamalar için kullanılabilir: hedefe özgü onkolitik viral tedaviler; canlı virüs aşılarının risksiz; hayvan modellerinin iyileştirilmesi, tahmin edilmesi veya seçilmesi; konak aralığı veya duyarlılık tahmini; zoonotik olayların tahmini; ve ev sahibi savunma tahmini. Açıklanan yöntemler sıra tabanlı olduğundan, gelecekte yazılıma dahil edilmeleri açısından değerli olabilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Savunma Tehdit Azaltma Ajansı (DTRA) proje numaraları CB-SEED-SEED09-2-0061 ve CBCall4-CBM-05-2-0019 ve kısmen NCATS, NIH (XH) ve Deniz Araştırma Laboratuvarı baz fonlarının Intramural/Extramural araştırma programı tarafından desteklenmiştir.
250 mL Erlenmeyer Flask | VWR | 89000-362 | |
2-mercaptoethanol | Acros Organics (Fisher) | 125472500 | Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes. |
4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap | Millipore Sigma | CLS49954L-1EA | |
AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 17-0729-01 | |
AKTA XK 16/20 Column | GE Healthcare | 28988937 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC501096 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901096 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC801024 | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | Danger: Allergic reactions (skin or breathing). |
Chelating Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0575-02 | Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer. |
Chloramphenicol | RPI | C61000 | Danger: May cause cancer. |
Corning 50 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes |
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface | Corning | 3993 | |
Dialysis Tubing Clips | Fisher Scientific | PI68011 | |
Disposable PD-10 Desalting Column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
DNAse | Sigma | DN25-1G | |
DTT (DL-Dithiothreitol) | RPI | D11000-50.0 | Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Glycerol | Acros Organics (Fisher) | 15892-0010 | |
HEPES | Millipore Sigma | H4034-1KG | |
Imidazole | Acros Organics | 301870010 | Danger: Toxic, Irritant |
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) | Calbiochem (Millipore Sigma) | 420291 | Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin. |
Laemmli Sample Buffer | BIO-RAD | 1610737 | |
Luria Bertani Agar | Fluka (Millipore Sigma) | L3027-1KG | Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds. |
Luria Bertani Media | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | |
Lysozyme | Sigma | L4919-5g | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box | BIO-RAD | ||
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Nalgene (Thermo Scientific) | 3119-0050 | |
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator | Eppendorf | M1335 | |
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | N73-500 | Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation |
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C600003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C606003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
pet15b plasmid DNA | Novagen (Millipore Sigma) | 69661 | GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates. |
pet32b | Novagen (Millipore Sigma) | 69016-3 | The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct. |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher | A32955 | Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage |
Plate Reader | Molecular Devices | Model M5 | |
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard | BIO-RAD | 161-0373 | |
Protein Extraction Reagent | Novagen (Millipore Sigma) | 70584-4 | BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher) |
Q-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0510-01 | Anion exchange resin |
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels | Expedeon | BCG01227 | Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used |
RunBlue 20x SDS Running Buffer | Expedeon | NXB50500 | Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x |
RunBlue Instant Blue Gel Stain | Expedeon | ISB1L | Do not dilute, use as directed |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271-10 | |
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator | Branson Ultrasonics (VWR) | Model No. 101-063-346R | Sonicator was used on level 5 |
Spectra/Por 6-8 kD MWCO | Spectrum Labs | 132645T | Dialysis Tubing |
SP-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0729-01 | Cation exchange resin |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T6634-500UN | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Caution: Eye/Skin Irritant |