Wir präsentieren ein allgemeines Protokoll zur Identifizierung kurzer Strecken homologe Wirt-Pathogen-Proteinsequenzen (SSHHPS), die in das virale Polyprotein eingebettet sind. SSHHPS werden durch virale Proteasen erkannt und leiten die gezielte Zerstörung bestimmter Wirtsproteine durch mehrere Viren der Gruppe IV.
Alphavirale Enzyme werden in einem einzigen Polypeptid synthetisiert. Das nichtstrukturelle Polyprotein (nsP) wird von seiner nsP2-Cysteinprotease verarbeitet, um aktive Enzyme zu produzieren, die für die Virusreplikation unerlässlich sind. Virale Proteasen sind hochspezifisch und erkennen konservierte Spalt-Standort-Motivsequenzen (ca. 6-8 Aminosäuren). In mehreren Virusarten der Gruppe IV finden sich die Motivsequenzen der nsP-Protease(s) In bestimmten Wirtsproteinen, die an der Erzeugung der angeborenen Immunantworten beteiligt sind, und in einigen Fällen scheinen die zielgerichteten Proteine mit dem virusinduzierten Phänotyp in Verbindung zu stehen. Diese Viren nutzen kurze Strecken homologe Wirt-Pathogen-Proteinsequenzen (SSHHPS) zur gezielten Zerstörung von Wirtsproteinen. Zur Identifizierung von SSHHPS können die viralen Proteasespaltungs-Standort-Motivsequenzen in BLAST eingegeben und die Wirtsgenome durchsucht werden. Cleavage kann zunächst mit den gereinigten nsP-Virusprotease- und Fluoreszenzresonanz-Energieübertragungssubstraten (FRET) aus E. coligetestet werden. Die FRET-Substrate enthalten Cyan- und Gelbfluoreszenzprotein und die Spaltungs-Standortsequenz (CFP-Sequenz-YFP). Dieser Protease-Assay kann kontinuierlich in einem Plattenleser oder diskontinuierlich in SDS-PAGE Gelen eingesetzt werden. Modelle der gebundenen Peptidsubstrate können in Silico erzeugt werden, um Substratauswahl- und Mutagenesestudien zu leiten. GFP/YFP-Substrate wurden auch verwendet, um Proteasehemmer zu identifizieren. Diese In-vitro- und Silico-Methoden können in Kombination mit zellbasierten Assays verwendet werden, um festzustellen, ob das Ziel-Wirtsprotein die Virusreplikation beeinflusst.
Beweise für einen horizontalen Gentransfer vom Virus zum Wirt oder wirt zu Virus, können in einer Vielzahl von Genomengefundenwerden 1,2,3,4. Beispiele für virale Endogenisation sind die CRISPR-Abstandssequenzen, die in bakteriellen Wirtsgenomen gefunden werden4. Kürzlich haben wir Hinweise auf Wirtsproteinsequenzen gefunden, die in die nichtstrukturellen Polyproteine von (+)ssRNA Group IV-Viren eingebettet sind. Diese Sequenzen innerhalb der kodierenden Bereiche des viralen Genoms können generationell vermehrt werden. Die kurzen Strecken homologe Wirt-Pathogen-Proteinsequenzen (SSHHPS) finden sich im Virus und Wirt5,6. SSHHPS sind die konservierten Spalt-Standort-Motivsequenzen, die von viralen Proteasen erkannt werden, die Homologie zu bestimmten Wirtsproteinen haben. Diese Sequenzen leiten die Zerstörung bestimmter Wirtsproteine.
In unserer vorherigen Publikation6haben wir eine Liste aller Wirtsproteine zusammengestellt, die von viralen Proteasen angegriffen wurden, und festgestellt, dass die Liste der Ziele nicht zufällig war (Tabelle 1). Zwei Trends waren offensichtlich. Erstens gehörte die Mehrheit der viralen Proteasen, die Wirtsproteine schneiden, zu Denkowerviren der Gruppe IV (24 von 25 Fällen betrafen virale Proteasen der Gruppe IV), und eine Protease gehörte zur (+)ssRNA-Gruppe VI-Retroviren (HIV, Human Immunodeficiency Virus)7. Zweitens waren die Wirtsproteinziele, die von den viralen Proteasen geschnitten wurden, im Allgemeinen an der Generierung der angeborenen Immunantworten beteiligt, was darauf hindeutet, dass die Spaltungen dazu bestimmt waren, die Immunantworten des Wirts zu verankern. Die Hälfte der von den viralen Proteasen ins Visier genommenen Wirtsproteine waren bekannte Bestandteile von Signalkaskaden, die Interferon (IFN) und proinflammatorische Zytokine erzeugen (Tabelle 1). Andere waren an der Hostzellentranskription8,9,10 oder Translation11beteiligt. Interessanterweise haben Shmakov et al.4 gezeigt, dass viele CRISPR Protospacer-Sequenzen Genen entsprechen, die an Derplasmakonjugation oder Replikation beteiligt sind4.
Gruppe IV umfasst unter anderem Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae und Togaviridae. Mehrere neue und neu auftretende Krankheitserreger gehören zur Gruppe IV wie das Zika-Virus (ZIKV), West-Nil (WNV), Chikungunya (CHIKV), das schwere akute Atemwegssyndrom (SARS) und das Atemwegssyndrom -virus (MERS) im Nahen Osten. Das (+)ssRNA-Genom ist im Wesentlichen ein Stück mRNA. Um die für die Genomreplikation notwendigen Enzyme zu produzieren, muss zunächst das (+)ssRNA-Genom übersetzt werden. Bei Alphaviren und anderen Viren der Gruppe IV werden die für die Replikation notwendigen Enzyme in einem einzigen Polyprotein (d. h. nsP1234 für VEEV) hergestellt. Das nichtstrukturelle Polyprotein (nsP) wird proteolytisch verarbeitet (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) durch die nsP2-Protease zur Herstellung aktiver Enzyme12 (Abbildung 1). Die Spaltung des Polyproteins durch die nsP2-Protease ist für die Virusreplikation unerlässlich; Dies wurde durch Deletion und standortgesteuerte Mutagenese der aktiven Stelle Cystein der nsP2-Protease13,14demonstriert. Insbesondere die Translation viraler Proteine geht genomischen Replikationsereignissen voraus. Beispielsweise enthält nsP4 die RNA-abhängige RNA-Polymerase, die zur Replikation des (+)ssRNA-Genoms erforderlich ist. Die Genomreplikation kann dsRNA-Zwischenprodukte erzeugen; Diese Zwischenprodukte können die angeborenen Immunreaktionen des Wirts auslösen. So können diese Viren Wirt angeborene Immunantwort Proteine früh in der Infektion spalten, um ihre Wirkung zu unterdrücken15,16,17.
Silencing kann auf der Ebene von DNA, RNA und Protein auftreten. Was jedem der in Abbildung 1 gezeigten Silencing-Mechanismen gemeinsam ist, ist, dass kurze fremde DNA-, RNA- oder Proteinsequenzen verwendet werden, um die Zerstörung bestimmter Ziele zu steuern, um ihre Funktion zu veranschlagen. Die Silencing-Mechanismen sind analog zu “Suchen und Löschen” von Programmen, die in drei verschiedenen Sprachen geschrieben wurden. Die kurze Spaltungs-Site-Sequenz ist analog zu einem “Schlüsselwort”. Jedes Programm hat ein Enzym, das die Übereinstimmung zwischen der kurzen Sequenz (das “Schlüsselwort”) und einem Wort in der “Datei” erkennt, das gelöscht werden soll. Sobald eine Übereinstimmung gefunden ist, schneidet das Enzym die größere Zielsequenz (“löscht”). Die drei in Abbildung 1 gezeigten Mechanismen werden verwendet, um den Wirt vor Viren zu schützen oder um ein Virus vor dem Immunsystem eines Hosts zu schützen.
Virale Proteasen erkennen kurze Spalt-Standort-Motivsequenzen zwischen 2-11 Aminosäuren; in Nukleotiden würde dies 6-33 Basen entsprechen. Zum Vergleich: CrispR-Abstandssequenzen sind Nukleotide von 26-72 und RNAi sind Nukleotide18,19. Obwohl diese Sequenzen relativ kurz sind, können sie spezifisch erkannt werden. Angesichts der höheren Vielfalt an Aminosäuren ist die Wahrscheinlichkeit eines zufälligen Spaltungsereignisses für eine virale Protease, die Proteinsequenzen von 6-8 Aminosäuren oder länger erkennt, relativ gering. Die Vorhersage von SSHHPS in Wirtsproteinen wird weitgehend von der Spezifität der untersuchten viralen Protease abhängen. Wenn die Protease strenge Sequenzspezifitätsanforderungen hat, beträgt die Wahrscheinlichkeit, eine Spaltungs-Standortsequenz zu finden, 1/206 = 1 in 64 Millionen oder 1/208 = 1 in 25,6 Milliarden; Die meisten Proteasen weisen jedoch variable Untersitetoleranzen auf (z. B. können R oder K am Standort S1 toleriert werden). Folglich ist keine Sequenzidentität zwischen den Sequenzen, die auf dem Host gefunden werden, und dem Virus erforderlich. Bei viralen Proteasen, die lockerere Sequenzanforderungen haben (z. B. bei Picornaviridae), kann die Wahrscheinlichkeit, eine Spaltungsstelle in einem Wirtsprotein zu finden, höher sein. Viele der Einträge in Tabelle 1 stammen aus der Familie der Picornaviridae.
Schechter & Berger Notation20 wird häufig verwendet, um die Rückstände in einem Proteasesubstrat und die Untersits, an die sie binden, zu beschreiben, verwenden wir diese Notation durchgehend. Die Rückstände im Substrat, die N-Terminal der Sissile-Bindung sind, werden als P3-P2-P1 bezeichnet, während die Rückstände, die C-Terminal sind, als P1′-P2′-P3′ bezeichnet werden. Die entsprechenden Untersiten in der Protease, die diese Aminosäurerückstände binden, sind S3-S2-S1 bzw. S1′-S2′-S3′.
Um zu bestimmen, welche Wirtsproteine ins Visier genommen werden, können wir SSHHPS in den viralen Polyproteinspaltungsstellen identifizieren und nach den Wirtsproteinen suchen, die sie enthalten. Hierin skizzieren wir Verfahren zur Identifizierung von SSHHPS mit bekannten viralen Proteasespaltungs-Site-Sequenzen. Die bioinformatischen Methoden, Protease-Assays und in silico-Methoden sollen in Verbindung mit zellbasierten Assays verwendet werden.
Sequenzausrichtungen der Wirtsproteine, die von viralen Proteasen angegriffen werden, haben artspezifische Unterschiede innerhalb dieser kurzen Spalt-Standortsequenzen aufgedeckt. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass das venezolanische Pferdeenzephalitisvirus (VEEV) nsP2-Protease das menschliche TRIM14, ein dreigliedriges Motiv (TRIM) Protein6, schneidet. Einige TRIM-Proteine sind virale Restriktionsfaktoren (z.B. TRIM5-21), die meisten gelten vermutlich als Ubiquitin E3-Ligasen. TRIM14 verfügt nicht über eine RING-Domain (wirklich interessantes neues Gen) und wird nicht als E3-Ligase22angesehen. TRIM14 wurde als Adapter in der mitochondrialen antiviralen Signalososome (MAVS)22vorgeschlagen, kann aber andere antivirale Funktionen haben23. Die Ausrichtung der TRIM14-Sequenzen verschiedener Arten zeigt, dass Pferde nicht die Spaltungsstelle haben und eine abgeschnittene Version von TRIM14 beherbergen, die die C-Terminal PRY/SPRY-Domäne vermisst. Diese Domäne enthält eine Polyubiquitinationsstelle (Abbildung 2). Bei Pferden sind diese Viren hochgradig tödlich (20-80% Mortalität), während beim Menschen nur 1% an VEEV-Infektionen sterben24. Die Cleavage der PRY/SPRY-Domäne kann die MAVS-Signalkaskade vorübergehend kurzschließen. Diese Kaskade kann durch dsRNA ausgelöst werden und führt zur Produktion von Interferon und pro-inflammatorischen Zytokinen. Daher kann das Vorhandensein der SSHHPS nützlich sein, um vorherzusagen, welche Arten Abwehrsysteme gegen bestimmte Viren der Gruppe IV haben.
In der Gruppe IV viren werden IFN-Antagonismusmechanismen als multipliziert redundant25angenommen. Die Dekolleté des Wirtskann während der Infektion vorübergehend sein und die Konzentrationen können sich im Laufe der Zeit erholen. Wir fanden in Zellen, dass TRIM14-Spaltungsprodukte sehr früh nach Transfektion (6 h) mit einem Plasmid nachgewiesen werden konnten, das die Protease (Cytomegalievirus-Promotor) kodiert. Länger wurden die Spaltprodukte jedoch nicht nachgewiesen. In virusinfizierten Zellen war die Kinetik unterschiedlich und Spaltprodukte konnten zwischen 6-48 h6nachgewiesen werden. Andere haben das Auftreten von Wirtprotein-Spaltungsprodukte bereits 3-6 h nach der Infektion9,11berichtet.
Proteolytische Aktivität in Zellen ist oft schwer zu fangen; die Spaltprodukte können in ihrer Löslichkeit, Konzentration, Stabilität und Lebensdauer variieren. In zellbasierten Assays kann nicht davon ausgegangen werden, dass sich Spaltprodukte in einer Zelle ansammeln oder dass die Bandintensitäten von geschnittenem und ungeschnittenem Protein kompensatorische Zu- und Abnahmen aufweisen, da das geschnittene Protein sehr schnell abgebaut werden kann und möglicherweise nicht in einem westlichen Fleck bei einem erwarteten Molekulargewicht (MW) nachweisbar ist (z. B. könnte die Region, die das Epitop enthält, von anderen Wirtsproteasen geklammert werden oder ubiiniert werden könnten). Wenn das Substrat der viralen Protease ein angeborenes Immunantwortprotein ist, kann seine Konzentration während der Infektion variieren. Zum Beispiel sind einige angeborene Immunantwortproteine vor einer Virusinfektion vorhanden und werden durch Interferon26weiter induziert. Die Konzentration des Zielproteins kann daher während der Infektion schwanken, und der Vergleich von nicht infizierten vs. infizierten Zelllysaten kann schwer zu interpretieren sein. Darüber hinaus dürfen nicht alle Zellen gleichmäßig transfiziert oder infiziert sein. In-vitro-Protease-Assays mit gereinigten Proteinen aus E. coli haben dagegen weniger Variablen, für die sie zu kontrollieren sind, und solche Assays können mit SDS-PAGE statt mit Immunoblots durchgeführt werden. Kontaminierende Proteasen können in den frühen Schritten der Proteinreinigung des CFP/YFP-Substrats gehemmt werden, und mutierte virale Proteasen können gereinigt und als Kontrollen getestet werden, um festzustellen, ob die Spaltung auf die virale Protease oder eine kontaminierende bakterielle Protease zurückzuführen ist.
Eine Einschränkung der In-vitro-Protease-Assays ist, dass ihnen die Komplexität einer Säugetierzelle fehlt. Damit ein Enzym sein Substrat schneidet, müssen die beiden kolokalisiert sein. Virale Proteasen der Gruppe IV unterscheiden sich in Struktur und Lokalisierung. Zum Beispiel ist die ZIKV-Protease in die endoplasmatische Retikulum -Membran (ER) eingebettet und steht dem Zytosol gegenüber, während die VEEV nsP2-Protease ein lösliches Protein im Zytoplasma und Kern27ist. Einige der in der ZIKV-SSHHPS-Analyse gefundenen Spaltungs-Standortsequenzen waren in Signalpeptiden, die darauf hindeuten, dass Spaltung für einige Ziele ko-translational auftreten könnte. Daher muss bei diesen Analysen auch die Lage der Protease und des Substrats in der Zelle berücksichtigt werden.
Zellbasierte Assays können wertvoll sein, um eine Rolle für das identifizierte Wirtsprotein(e) bei Infektionen zu etablieren. Methoden, die darauf abzielen, die virale Proteasespaltung von Wirtsproteinen zu stoppen, wie die Zugabe eines Proteasehemmers6 oder eine Mutation im Wirtsziel16, können verwendet werden, um ihre Auswirkungen auf die Virusreplikation zu untersuchen. Eine Überexpression des Zielproteins kann auch die Virusreplikation beeinträchtigen28. Plaque-Assays oder andere Methoden können verwendet werden, um die Virusreplikation zu quantifizieren.
Die sequenzspezifische Zerstörung eines Proteins oder einer Nukleinsäure, die von einer fremden Sequenz geleitet wird, ist nur in wenigen Fällen in der Biologie zu beobachten. Die in Abbildung 1 dargestellten Mechanismen sind Abwehrmechanismen, die einen Host vor einem Virus oder einen Virus von einem Host schützen.
Mit bioinformatischen Methoden können wir die Ziele identifizieren, die durch diese Systeme zerstört werden. In unseren Analysen von SSHHP-Sequenzen entdeckten wir, dass viele von ihnen in Proteinen gefunden werden konnten, die benötigt werden, um angeborene Immunantworten zu erzeugen. Einige hatten offensichtliche Rollen wie MAVS und TRIF (TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-‘), während andere mit Immunität durch komplexere Mechanismen (z.B. Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9zusammenhängen. Die in der SSHHP-Sequenz gespeicherten Zielinformationen haben das Potenzial, Wege zu identifizieren, die antivirale Auswirkungen gegen diese Viren haben. Antivirale Reaktionen in vivo sind oft virusspezifisch26,43. Zum Beispiel haben Teilmengen von TRIM-Proteinen antivirale Wirkungen auf verschiedene Viren43,44,45, einige sind virale Restriktionsfaktoren (z. B. HIV und TRIM5). Die Spezifität von TRIM-Proteinen (70 wurden identifiziert) wird noch untersucht44,45. Die Informationen innerhalb von SSHHPS können zu unserem Verständnis beitragen, wie diese Viren den angeborenen Immunreaktionen entgehen. Andere Muster und Korrelationen können aufgedeckt werden, wenn mehr SSHHPS untersucht werden.
In unseren Analysen zeigten sich artspezifische Unterschiede (Abbildung 2, Abbildung 10). Es ist bekannt, dass diese Viren einige Arten stärker betreffen als andere. Informationen über Hostbereich, Hostanfälligkeit und Hostverteidigung können in SSHHPS vorhanden sein. Zum Beispiel fehlte Pferde, der anfälligsten Art für Pferdeenzephalitisviren, die Region des menschlichen TRIM14, die vorübergehend von der VEEV nsP2 Protease geschnitten wurde. Menschen sterben selten an VEEV-Infektionen, können aber infiziert werden24. Das humane TRIM14-Protein trug eine nsP2-Proteasespaltungssequenz6. Das Vorhandensein der Spaltungsstelle deutet darauf hin, dass Menschen einen Abwehrmechanismus gegen diese Viren haben. Vögel wurden als potenzielle Reservoirs dieser Viren gedacht46. Die entsprechende SSHHP-Sequenz im TRIM14-Protein von Hühnern unterschied sich von den Sequenzen, die beim Menschen und anderen Arten gefunden wurden. Subtile Unterschiede wie diese können ein Ziel-Wirt-Protein uncleavable oder leichter spalten. Aguirre et al.16 zeigten, dass ein onkelwältbar esmutiertes STRING-Protein nach der Dengue-Virusinfektion höhere IFN-Konzentrationen induzierte und dass Mäuse natürlicherweise eine Version von STING tragen, die nicht von der Dengue ns2B3 Protease geschnitten wird. Das murine STING-Protein wurde von der ZIKV-Protease47nicht geschnitten. In unserer SSHHPS-Analyse beobachteten wir auch Unterschiede in den ZIKV-Proteasespaltungs-Standortsequenzen, wenn wir die menschlichen Proteine mit denen von Nagetieren verglichen6 (Abbildung 10D). Die Reproduktion der artspezifischen proteolytischen Spaltungen von Wirtsproteinen kann in Tiermodellen, die für Viren der Gruppe IV verwendet werden, von Bedeutung sein. Die Hemmung der Dekolleté-Spaltung des Wirtsproteins hat auch Auswirkungen auf die Entwicklung von Proteasehemmern der Gruppe IV. In unserer vorherigen Publikation haben wir gezeigt, dass wir trim14 Spaltung durch die VEEV nsP2 Protease mit CA074 Methylester6hemmen können. Dieses Ergebnis legt nahe, dass kleine Molekülinhibitoren dieser Proteasen in der Lage sein könnten, die angeborenen Immunantworten zu modulieren, die in der Lage sind, die Infektion zu unterdrücken6,31.
Genetische Variation innerhalb einer Art hat auch das Potenzial, Unterschiede in der proteolytischen Spaltung zu produzieren. Subtile Unterschiede in der Codon-Nutzung könnten ribosome Pausieren48beeinflussen. Da einige virale Proteasen der Gruppe IV in die ER-Membran eingebettet sind, können Unterschiede in diesen Pausen die Spaltung eines Ziels beeinflussen, wenn die Spaltung ko-translational auftritt. Einige der von uns identifizierten Spaltungsstellen befanden sich in vorhergesagten Signalpeptidsequenzen (z. B. SFRP1), während andere intern waren.
Die SSHHPS-Analyse kann Informationen liefern, die sich von anderen Methoden der Wirtsproteinanalyse unterscheiden. Die SSHHPS-Analyse war kostengünstig und einfach zu verwenden. Die Verwendung eines bakteriellen Expressionssystems ermöglichte das Testen von kurzen Segmenten (25 Aminosäuren) von Säugetiersequenzen ohne die Verwendung von Säugetierzellkultur. Wir fanden heraus, dass die CFP-YFP-Substrate in der Lage waren, alle getesteten menschlichen Proteinsequenzen zu tolerieren; die Erträge jedoch unterschiedlich. In ähnlichen Assays wurden Substrate, die menschliche Proteinsequenzen enthalten, solange 63 Aminosäuren erfolgreich exprimiert, gereinigt und für kinetische Analysen und Inhibitor-Screening49,50,51verwendet. Da für den diskontinuierlichen Assay nur geringe Mengen des Substrats benötigt werden, kann eine große Anzahl von Zielen untersucht werden. Ein Vorteil des Systems ist, dass die CFP/YFP-Substrate für SDS-PAGE-Analysen und für aufwendigere kinetische Analysen (z.B. IC50, Ki, Km, Vmax)verwendet werden können. Für die Entdeckung von Arzneimitteln können hemmende Verbindungen Artefakte in fluoreszierenden Assays produzieren. So ermöglicht der diskontinuierliche Assay in Kombination mit einem kontinuierlichen Assay, die Spaltung oder Hemmung der Spaltung zu bestätigen. Die Proben für den diskontinuierlichen SDS-PAGE-Assay können direkt aus den 96-Well-Platten entnommen werden. CFP/YFP-Substrate wurden für das Screening von Verbundbibliotheken52verwendet. Es sind jedoch zusätzliche Analysen erforderlich, um festzustellen, ob ein Substrat für ein Hochdurchsatzscreening geeignet ist, wie z.B. die Berechnung eines Z-Faktors53.
Eine Herausforderung bei der Gestaltung eines Substrats besteht darin, die Region um die sissile Bindung zu identifizieren, die von der Protease gebunden und erkannt wird. In den hier gezeigten Beispielen begannen wir mit 12 Rückstandssequenzen, die um die sissile Bindung zentriert waren. Nach der Analyse der Sequenzausrichtungen der Spaltungsstellen wurde für die VEEV-Protease eine Homologie zu den Rückständen gefunden, N-Terminal der Sissile-Bindung, während für die ZIKV-Proteasehomologie mehrere der C-Terminal-Rückstände gefunden wurden. Ein in silico Modell des angedockten Substrats kann verwendet werden, um standortgesteuerte Mutageneseexperimente zu entwerfen, die die Bindungsstellen des Substrats untersuchen. Da sich die Substrat- und Enzymsequenzen auf Plasmiden befinden, können entweder die in silico-Modelle oder die Subsite-Toleranzen mutiert werden. Dies kann von Vorteil sein, wenn eine Kristallstruktur des gebundenen Substrats nicht verfügbar ist.
Die SSHHPS-Analyse kann auch neue Informationen über die Mechanismen liefern, mit denen virusinduzierte Phänotypen durch virale Enzyme erzeugt werden. Eines der ZIKV-Ziele, SFRP1, ist Teil des Wnt-Signalwegs und hat Rollen sowohl in der Gehirn- und Augenentwicklung als auch in den Immunantworten36,37,54,55,56,57. Wir fanden heraus, dass die anderen Proteinsequenzen, die durch die ZIKV ns2B/ns3 Protease geschnitten werden konnten, auch in Proteinen an der Entwicklung von Gehirn und Auge beteiligt waren; Anomalien in beiden wurden beim angeborenen Zika-Syndrom beobachtet und gelten als Teil des virusinduzierten Phänotyps58.
Die Vorhersehbarkeit von Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen könnte für eine Vielzahl von Anwendungen genutzt werden: zielspezifische onkolytische virale Therapien; Entrisiko von Impfstoffen gegen lebende Viren; Verfeinerung, Vorhersage oder Auswahl von Tiermodellen; Vorhersage des Wirtsbereichs oder der Anfälligkeit; Vorhersage von Zoonose-Ereignissen; und Vorhersage der Host-Verteidigung. Da die beschriebenen Methoden sequenzbasiert sind, können sie von Nutzen sein, um sie in Zukunft in Software zu integrieren.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von den Projektnummern CB-SEED-SEED09-2-0061 und CBCall4-CBM-05-2-0019 und teilweise vom Intramural/Extramural-Forschungsprogramm der Basisfonds NCATS, NIH (XH) und Naval Research Laboratory unterstützt.
250 mL Erlenmeyer Flask | VWR | 89000-362 | |
2-mercaptoethanol | Acros Organics (Fisher) | 125472500 | Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes. |
4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap | Millipore Sigma | CLS49954L-1EA | |
AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 17-0729-01 | |
AKTA XK 16/20 Column | GE Healthcare | 28988937 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC501096 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901096 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC801024 | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | Danger: Allergic reactions (skin or breathing). |
Chelating Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0575-02 | Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer. |
Chloramphenicol | RPI | C61000 | Danger: May cause cancer. |
Corning 50 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes |
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface | Corning | 3993 | |
Dialysis Tubing Clips | Fisher Scientific | PI68011 | |
Disposable PD-10 Desalting Column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
DNAse | Sigma | DN25-1G | |
DTT (DL-Dithiothreitol) | RPI | D11000-50.0 | Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Glycerol | Acros Organics (Fisher) | 15892-0010 | |
HEPES | Millipore Sigma | H4034-1KG | |
Imidazole | Acros Organics | 301870010 | Danger: Toxic, Irritant |
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) | Calbiochem (Millipore Sigma) | 420291 | Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin. |
Laemmli Sample Buffer | BIO-RAD | 1610737 | |
Luria Bertani Agar | Fluka (Millipore Sigma) | L3027-1KG | Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds. |
Luria Bertani Media | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | |
Lysozyme | Sigma | L4919-5g | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box | BIO-RAD | ||
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Nalgene (Thermo Scientific) | 3119-0050 | |
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator | Eppendorf | M1335 | |
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | N73-500 | Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation |
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C600003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C606003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
pet15b plasmid DNA | Novagen (Millipore Sigma) | 69661 | GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates. |
pet32b | Novagen (Millipore Sigma) | 69016-3 | The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct. |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher | A32955 | Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage |
Plate Reader | Molecular Devices | Model M5 | |
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard | BIO-RAD | 161-0373 | |
Protein Extraction Reagent | Novagen (Millipore Sigma) | 70584-4 | BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher) |
Q-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0510-01 | Anion exchange resin |
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels | Expedeon | BCG01227 | Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used |
RunBlue 20x SDS Running Buffer | Expedeon | NXB50500 | Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x |
RunBlue Instant Blue Gel Stain | Expedeon | ISB1L | Do not dilute, use as directed |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271-10 | |
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator | Branson Ultrasonics (VWR) | Model No. 101-063-346R | Sonicator was used on level 5 |
Spectra/Por 6-8 kD MWCO | Spectrum Labs | 132645T | Dialysis Tubing |
SP-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0729-01 | Cation exchange resin |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T6634-500UN | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Caution: Eye/Skin Irritant |