우리는 바이러스성 다단백질에 내장된 상동 호스트 병원체 단백질 서열(SSHHPS)의 짧은 스트레칭을 확인하기 위한 일반적인 프로토콜을 제시한다. SSHHPS는 바이러스 성 프로테아제에 의해 인식되고 여러 그룹 IV 바이러스에 의해 특정 숙주 단백질의 표적 파괴를 지시한다.
알파바이러스 효소는 단일 폴리펩티드에서 합성됩니다. 비구조적 다단백(nsP)은 nsP2 시스테인 프로테아제에 의해 처리되어 바이러스 복제에 필수적인 활성 효소를 생성합니다. 바이러스성 프로테아제는 매우 특이적이고 보존된 분열 부위 모티프 서열(~6-8 아미노산)을 인식한다. 여러 그룹 IV 바이러스에서, nsP 프로테아제(들) 절단 부위 모티프 서열은 선천적인 면역 반응을 생성하는 데 관여하는 특정 숙주 단백질에서 발견될 수 있으며, 경우에 따라 표적 화된 단백질은 바이러스 유발 표현형에 연결되는 것으로 보인다. 이 바이러스는 호스트 단백질의 표적으로 한 파괴를 위한 상동 호스트 병원체 단백질 서열 (SSHHPS)의 짧은 뻗어를 이용합니다. SSHHPS를 식별하기 위해 바이러스 성 프로테아제 절단 부위 모티프 서열을 BLAST로 입력할 수 있고 숙주 게놈(들)을 검색할 수 있다. 분열은 초기에 대장균에서만들어진 정제된 nsP 바이러스 성 프로테아제 및 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기판을 사용하여 시험될 수 있다. FRET 기질은 청색 및 황색 형광 단백질 및 절단 부위 서열(CFP-서열-YFP)을 함유한다. 이러한 프로테아제 분석제는 플레이트 리더에서 지속적으로 사용되거나 SDS-PAGE 겔에서 연속상으로 사용될 수 있다. 결합된 펩티드 기판의 모델은 실리코에서 생성되어 기질 선택 및 돌연변이 발생 연구를 안내할 수 있다. CFP/YFP 기판은 또한 프로테아제 억제제 식별에 활용되었습니다. 이러한 시험관내 및 실리코 방법에서는 표적 숙주 단백질이 바이러스 복제에 영향을 미치는지 확인하기 위해 세포 기반 세포 기반 검사법과 함께 사용될 수 있다.
바이러스에서 호스트로 또는 호스트에서 바이러스로의 수평 유전자 전달의 증거는 다양한 게놈1,2,3,4에서찾을 수 있습니다. 바이러스 내인성화의 예는 세균 숙주 게놈4에서발견되는 CRISPR 스페이서 서열이다. 최근에, 우리는 (+)ssRNA 그룹 IV 바이러스의 비구조적 다단백질에 내장된 숙주 단백질 서열의 증거를 발견했다. 바이러스 게놈의 코딩 영역 내에서 이러한 서열은 세대적으로 전파될 수 있다. 상동 숙주-병원체 단백질 서열(SSHHPS)의 짧은 스트레칭은 바이러스 및 숙주5,6에서발견된다. SSHHPS는 특정 숙주 단백질에 대한 상동성을 가지는 바이러스 성 프로테아제에 의해 인식된 보존된 분열 부위 모티프 서열이다. 이 서열은 특정 숙주 단백질의 파괴를 지시합니다.
우리의 이전 간행물6에서,우리는 바이러스 성 프로테아제에 의해 표적으로 된 모든 숙주 단백질의 목록을 컴파일하고 표적의 목록이 무작위가 아닌 것을 발견했습니다(표 1). 두 가지 추세가 분명했다. 먼저, 숙주 단백질을 절단하는 대부분의 바이러스 성 프로테아제는 그룹 IV 바이러스(25건 중 24건 중 24개 그룹 IV 바이러스 프로테아제)에 속하며, 1개의 프로테아제는 (+)ssRNA 그룹 VI 레트로바이러스(HIV, 인간 면역 결핍바이러스)에속한다. 7. 둘째, 바이러스 성 프로테아제에 의해 절단되는 숙주 단백질 표적은 일반적으로 분열이 숙주의 면역 반응을 길항하기 위한 것이었다는 것을 시사하는 선천적인 면역 반응을 생성하는데 관여했다. 바이러스 성 프로테아제에 의해 표적화된 숙주 단백질의 절반은 인터페론(IFN) 및 전염증성 사이토카인을 생성하는 시그널링 캐스케이드의 공지된 성분이었다(표1). 다른 사람들은 숙주 세포 전사8,9,10 또는 번역11에관여했다. 흥미롭게도, Shmakov 외4 많은 CRISPR 프로토스페이서 서열이 플라스미드 컨쥬게이션 또는복제에관여하는 유전자에 대응하는 것으로 나타났다 4.
그룹 IV에는 플라비리대, 피코나비리대, 코로나비리대, 칼시비리대, 토가비리대등이 포함됩니다. 몇몇 새로운 신흥 병원체는 Zika 바이러스 (ZIKV), 서쪽 나일강 (WNV), Chikungunya (CHIKV), 가혹한 심각한 호흡 증후군 바이러스 (SARS) 및 중동 호흡기 증후군 바이러스 (MERS)와 같은 그룹 IV에 속합니다. (+)ssRNA 게놈은 본질적으로 mRNA의 한 조각이다. 게놈 복제에 필요한 효소를 생성하기 위해, (+)ssRNA 게놈을 먼저 번역해야 한다. 알파바이러스 및 기타 그룹 IV 바이러스에서 복제에 필요한 효소는 단일 다단백질(즉, VEEV를 위한 nsP1234)에서 생성됩니다. 비구조적 다단백체(nsP)는 nsP2 프로테아제에 의해 프로테올리스 처리(nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4)로 활성효소를 생성한다(도1). nsP2 프로테아제에 의한 다단백질의 분열은 바이러스 복제에 필수적이다; 이는 nsP2 프로테아제13,14의활성 부위 시스테인의 결실 및 부위 지시 돌연변이 발생에 의해 입증되었다. 특히, 바이러스 성 단백질의 번역은 게놈 복제 사건을 선행합니다. 예를 들어, nsP4는 (+)ssRNA 게놈을 복제하는 데 필요한 RNA 의존성 RNA 폴리머라제를 함유한다. 게놈 복제는 dsRNA 중간을 생성할 수 있습니다; 이 중간체는 호스트의 타고난 면역 반응을 시작할 수 있습니다. 따라서, 이들 바이러스는 그들의 효과를 억제하기 위해 감염 초기에 숙주 면역 반응단백질을 15,16,17로갈라놓을 수 있다.
침묵은 DNA, RNA 및 단백질 의 수준에서 생길 수 있습니다. 도 1에 나타난 각 침묵 기전에서 공통되는 것은 짧은 외래 DNA, RNA 또는 단백질 서열이 그들의 기능을 길항하기 위해 특정 표적의 파괴를 유도하는 데 사용된다는 것입니다. 침묵 메커니즘은 세 가지 다른 언어로 작성된 “검색 및 삭제” 프로그램과 유사합니다. 짧은 분열 사이트 시퀀스는 “키워드”와 유사합니다. 각 프로그램에는 삭제할 “파일”의 짧은 시퀀스(“키워드”)와 단어 간의 일치를 인식하는 효소가 있습니다. 일치하는 것이 발견되면 효소는 더 큰 표적 서열을 잘라내게 됩니다(“삭제”). 그림 1에 표시된 세 가지 메커니즘은 호스트를 바이러스로부터 방어하거나 호스트의 면역 체계로부터 바이러스를 방어하는 데 사용됩니다.
바이러스 성 프로테아제는 ~ 2-11 아미노산 사이의 짧은 절단 부위 모티프 서열을 인식; 뉴클레오티드에서, 이것은 6-33 염기와 일치합니다. 비교를 위해, CRISPR 스페이서 서열은 ~26-72 뉴클레오티드 및 RNAi는 ~20-22 뉴클레오티드18,19이다. 이러한 서열은 비교적 짧지만 구체적으로 인식할 수 있습니다. 아미노산의 높은 다양성을 감안할 때, 무작위 분열 이벤트의 확률은 6-8 아미노산 이상 단백질 서열을 인식하는 바이러스 성 프로테아제에 대해 상대적으로 낮다. 숙주 단백질에서 SSHHPS의 예측은 주로 검사되는 바이러스 성 단백질의 특이성에 달려 있습니다. 프로테아제에 엄격한 서열 특이성 요구 사항이 있는 경우, 분열 부위 서열을 찾을 확률은 6,400만 개에1/20 6 = 1/208 = 1 에서 256억; 그러나 대부분의 프로테아제에는 가변 하위 사이트 허용 오차가 있습니다(예: R 또는 K는 S1 사이트에서 허용될 수 있음). 따라서 호스트에서 발견된 서열과 바이러스 간의 서열 ID에 대한 요구 사항은 없습니다. 느슨한 서열 요구 사항이 있는 바이러스 성 프로테아제의 경우(예: 피코나비리대에 속하는 것) 숙주 단백질에서 분열 부위를 찾을 확률이 더 높을 수 있다. 표 1의 많은 항목은 피코나비리대 가족입니다.
Schechter & Berger 표기법20은 일반적으로 프로테아제 기판 및 이들이 결합하는 서브사이트에서 잔기를 기술하는 데 사용되며, 우리는 이 표기법 전반에 걸쳐 활용한다. 가위 결합의 N-말단인 기판내의 잔기는 P3-P2-P1로 표시되고 C-단말은 P1′-P2′-P3’로 표시된다. 이들 아미노산 잔기와 결합하는 프로테아제의 상응하는 하위 부위는 각각 S3-S2-S1 및 S1′-S2′-S3’입니다.
어떤 숙주 단백질이 표적으로 되고 있는지 결정하기 위하여는, 우리는 바이러스성 다단백질 분열 사이트에 있는 SSHHPS를 확인하고 그(것)들을 포함하는 호스트 단백질을 검색할 수 있습니다. 본 명세서에서, 우리는 공지된 바이러스 성 프로테아제 절단 부위 서열을 사용하여 SSHHPS를 식별하기 위한 절차를 간략하게 설명한다. 생물정보학 방법, 프로테아제 검법 및 기재된 실리코 방법에서 세포 기반 검법과 함께 사용되기 위한 것이다.
바이러스 성 프로테아제에 의해 표적으로 한 숙주 단백질의 서열 정렬은 이 짧은 분열 사이트 서열 내의 종 특정 다름을 밝혔습니다. 예를 들어, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV) nsP2 프로테아제는 인간 TRIM14, 삼자모티프(TRIM) 단백질6을절단하는 것으로 나타났다. 일부 TRIM 단백질은 바이러스 제한 인자(예를 들어, TRIM5α21)이며,대부분은 유비퀴틴 E3 리가제인 것으로 생각된다. TRIM14는 링 (정말 흥미로운 새로운 유전자) 도메인이 부족하고 E3 ligase22로생각되지 않습니다. TRIM14는 미토콘드리아 항바이러스 신호(MAVS)22에서어댑터로 제안되었으나, 다른 항바이러스 기능을 가질 수있다(23). 다양한 종에서 TRIM14 서열의 정렬은 말절단 사이트가 부족하고 C 말단 PRY / SPRY 도메인이 누락 된 TRIM14의 잘린 버전을 항구 것을 보여줍니다. 이 도메인에는 폴리유비퀴틴화 사이트가 포함되어있습니다(그림 2). 말에서, 이 바이러스는 높게 치명적입니다 (~20-80% 사망) 반면 인간에서는 단지 ~1% VEEV 감염에서정지24. PRY/SPRY 도메인의 분열은 MAVS 시그널링 캐스케이드를 일시적으로 단락시킬 수 있다. 이 캐스케이드는 dsRNA에 의해 시작될 수 있고 인터페론 및 프로 염증성 사이토카인의 생산으로 이끌어 냅니다. 따라서, SSHHPS의 존재는 어떤 종들이 특정 그룹 IV 바이러스에 대한 방어 시스템을 가지고 있는지 예측하는데 유용할 수 있다.
그룹 IV 바이러스에서, IFN 길항 메커니즘은25를곱하는 것으로 생각된다. 숙주 단백질 절단은 감염 도중 일시적일 수 있고 사격량은 시간이 지남에 복구할 수 있습니다. 우리는 TRIM14 분열 제품이 프로테아제 (cytomegalovirus 프로모터)를 코딩하는 플라스미드와 함께 형질감염 (6 시간) 후에 아주 일찍 검출될 수 있었다는 것을 세포에서 찾아냈습니다. 그러나, 더 긴 기간에, 분열 제품은 검출되지 않았습니다. 바이러스에 감염된 세포에서는, 역학은 달랐고 분열 제품은 6-48 h6사이에서 검출될 수 있었습니다. 그 외는 3-6 시간 포스트 감염9,11로일찌기 호스트 단백질 분열 제품의 외관을 보고했습니다.
세포에서 의 체액 활성은 종종 잡기 어렵다; 분열 제품은 용해도, 집중력, 안정성 및 수명이 다를 수 있습니다. 세포 기반 세포 기반 세포 에서, 절단 제품이 세포에 축적되거나 절단 된 단백질의 밴드 강도가 매우 빠르게 저하 될 수 있으며 예상 분자량 (MW)에서 서양 얼룩에서 검출되지 않을 수 있으므로 보상 증가 및 감소를 보일 것이라고 가정 할 수 없습니다 (예를 들어, epitope를 포함하는 영역은 다른 숙주 protins에 의해 절단 될 수 있음). 바이러스 성 프로테아제의 기질이 선천적인 면역 반응 단백질인 경우, 감염 시 농도가 달라질 수 있다. 예를 들어, 일부 선천성 면역 반응 단백질은 바이러스 감염 이전에 존재하며 인터페론26에의해 추가로 유도된다. 표적 단백질의 농도는 감염 시 변동될 수 있으며 감염되지 않은 세포 와 감염된 세포 리세이스의 비교는 해석하기 어려울 수 있다. 추가적으로, 모든 세포는 균일하게 형질 감염되거나 감염되지 않을 수 있습니다. 반면에 대장균에서 정제된 단백질을 이용한 시험관내 프로테아제 분석실험은 면역혈전이 아닌 SDS-PAGE를 사용하여 조절할 수 있는 변수가 적다. 오염 프로테아제는 CFP/YFP 기판의 단백질 정제의 초기 단계에서 억제될 수 있으며, 돌연변이된 바이러스 성 프로테아제는 분열이 바이러스 성 프로테아제 또는 오염된 세균 성 프로테아제 때문인지 를 결정하기 위한 대조군으로서 정제 및 테스트될 수 있다.
시험관 내 프로테아제 시험법의 한 가지 제한은 포유류 세포의 복잡성이 부족하다는 것입니다. 효소가 기판을 절단하려면 두 가지를 공동 국소화해야 합니다. 그룹 IV 바이러스 성 프로테아제는 구조 및 국소화가 다릅니다. 예를 들어, ZIKV 프로테아제는 소포체(ER) 막에 내장되어 시토솔을 마주하는 반면, VEEV nsP2 프로테아제는 세포질 및핵(27)에서용해성 단백질이다. ZIKV SSHHPS 분석에서 발견된 일부 절단 부위 서열은 일부 표적에 대해 공동 번역으로 발생할 수 있음을 시사하는 신호 펩티드에 있었다. 따라서, 세포 내의 프로테아제 및 기판의 위치또한 이러한 분석에서 고려될 필요가 있다.
세포 기반 세포 계 검사는 감염에서 확인된 숙주 단백질(들)에 대한 역할을 확립하는 데 유용할 수 있다. 프로테아제 억제제6 또는 돌연변이를 숙주표적(16)에 첨가하는 것과 같은 숙주 단백질의 바이러스 성 프로테아제 절단을 중단시키는 것을 목표로 하는 방법은 바이러스 복제에 대한 그들의 효과를 조사하기 위해 사용될 수 있다. 표적 단백질의 과발현은 또한 바이러스 복제에 영향을 미칠 수 있다28. 플라크 검사 또는 다른 방법은 바이러스 복제를 정량화하는 데 사용될 수 있다.
외래 서열에 의해 유도된 단백질 또는 핵산의 서열 특이적 파괴는 생물학에서 단지 몇몇 경우에 볼 수 있다. 그림 1에 표시된 메커니즘은 호스트를 바이러스또는 호스트로부터 바이러스로부터 보호하는 방어 메커니즘입니다.
생물 정보학 방법을 사용하여 우리는 이러한 시스템에 의해 파괴되는 대상을 식별 할 수 있습니다. SSHHP 서열의 우리의 분석에서, 우리는 그(것)들의 많은 것이 타고난 면역 반응을 생성하는 데 필요한 단백질에서 찾아낼 수 있었다는 것을 것을을 발견했습니다. 일부는 MAVS 및 TRIF (TIR 도메인 함유 어댑터 -유도 인터페론-β)와 같은 명백한 역할을 가지고 있었고, 다른 것들은 더 복잡한 메커니즘 (예를 들어, 히스톤 H3, SFRP1, FOXG1)8,9. SSHHP 서열에 저장된 표적 정보는 이러한 바이러스에 대한 항 바이러스 효과가있는 경로를 식별 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 생체 내에서 항 바이러스 반응은 종종 바이러스 특이적26,43. 예를 들어, TRIM 단백질의 서브세트는 상이한 바이러스에 대한 항바이러스 효과를가지며, 43,44,45,일부는 바이러스 제한 인자(예를 들어, HIV 및 TRIM5α)이다. TRIM 단백질의 특이성 (~70이 확인됨)은 여전히44,45로조사되고 있다. SSHHPS 내의 정보는 이 바이러스가 타고난 면역 반응을 회피하는 방법의 우리의 이해에 기여할 수 있습니다. 더 많은 SSHHPS를 검사함에 따라 다른 패턴과 상관 관계가 발견될 수 있습니다.
종별 차이는 우리의 분석에서 명백하였다(그림 2, 그림 10). 이 바이러스는 그 외 보다는 몇몇 종에 더 많은 영향을 미치기 위하여 알려지고 있습니다. 호스트 범위, 호스트 감수성 및 호스트 방어에 대한 정보는 SSHHPS 내에 있을 수 있습니다. 예를 들면, 말, 말 뇌염 바이러스에 가장 영향을 받기 쉬운 종은, VEEV nsP2 프로테아제에 의해 일시적으로 절단된 인간 TRIM14의 지구를 결여했습니다. 인간은 VEEV 감염에서 거의 정지하지 않습니다 그러나24를감염될 수 있습니다. 인간 TRIM14 단백질은 nsP2 프로테아제 절단 서열6을운반하였다. 분열 사이트의 존재는 인간이 바이러스에 대하여 방어 기계장치가 있다는 것을 건의합니다. 조류는 이러한 바이러스46의잠재적 인 저수지로 생각되었다. 닭으로부터의 TRIM14 단백질에서 상응하는 SSHHP 서열은 인간 및 다른 종에서 발견되는 서열과 달랐다. 이와 같은 미묘한 차이는 표적 숙주 단백질을 더 쉽게 갈라놓을 수 있습니다. Aguirre등.16 뎅기열 바이러스 감염 후 IFN의 상부를 유도하는 삼촌 돌연변이 STRING 단백질과 그 마우스가 자연스럽게 뎅기열 ns2B3 프로테아제에 의해 절단되지 않는 STING의 버전을 운반하는 것으로 나타났다. 뮤린 스팅 단백질은 ZIKV 프로테아제47에의해 절단되지 않았다. 우리의 SSHHPS 분석에서, 우리는 또한 설치류의 것과 인간 단백질을 비교할 때 ZIKV 프로테아제 절단 부위 서열의 차이를 관찰했습니다(그림10D). 숙주 단백질의 종특이적 단백질용해 분열을 재현하는 것은 그룹 IV 바이러스에 사용되는 동물 모델에서 중요할 수 있다. 숙주 단백질 절단의 억제는 또한 그룹 IV 프로테아제 억제제의 발달에 관하여 연루가 있다. 우리의 이전 간행물에서, 우리는 우리가 CA074 메틸 에스테르6를사용하여 VEEV nsP2 프로테아제에 의해 TRIM14 절단을 억제 할 수 있음을 보여 주었다. 이 결과는 이러한 프로테아제의 소분자 억제제가 감염을 억제할 수 있는 선천적인 면역 반응을 조절할 수 있음을 시사한다6,31.
종 내의 유전 적 변이는 또한 단백질 분석 분열의 차이를 생성 할 수있는 잠재력을 가지고있다. 코돈 사용에 미묘한 차이 리보솜 일시 중지에 영향을 미칠 수있습니다 48. 몇몇 그룹 IV 바이러스성 proteases는 ER 막에 포함되기 때문에, 이 일시 정지에 있는 다름은 절단이 공동 번역으로 생기는 경우에 표적의 절단에 영향을 미칠 수 있었습니다. 우리가 확인한 분열 부위 중 일부는 예측된 신호 펩티드 서열(예를 들어, SFRP1)에 있었고, 다른 부위는 내부에 있었다.
SSHHPS 분석은 숙주 단백질 분석의 다른 방법과 다른 정보를 생성할 수 있습니다. SSHHPS 분석은 저렴하고 사용하기 쉬웠습니다. 세균 발현 시스템의 사용은 포유류 세포 배양을 사용하지 않고 포유류 서열의 짧은 세그먼트 (~25 아미노산)의 테스트를 허용했다. 우리는 CFP-YFP 기질이 시험된 인간 단백질 서열을 모두 견딜 수 있었다는 것을 발견했습니다; 그러나 수익률은 다양했습니다. 유사한 분석에서, 인간 단백질 서열을 함유하는 기질은 63개의 아미노산이 성공적으로 발현, 정제되고, 운동분석 및 억제제스크리닝49,50,51에활용되었다. 불연속 분석에 소량의 기판만 필요하기 때문에 많은 수의 표적을 탐색할 수 있습니다. 시스템의 한 가지 장점은 CFP/YFP 기판을 SDS-PAGE 분석 및 보다 정교한 운동 분석(예: IC50,Ki,Km,Vmax)에사용할 수 있다는 것입니다. 약물 발견을 위해, 억제 화합물은 형광 성 검사에서 유물을 생성 할 수 있습니다. 따라서, 연속 적인 분석과 결합된 불연속 분석법은 분열의 분열 또는 억제를 확인할 수 있게 한다. 불연속 SDS-PAGE 분석에 대한 샘플은 96웰 플레이트에서 직접 채취할 수 있습니다. CFP/YFP 기판은 화합물 라이브러리스크리닝(52)에사용되어 왔다. 그러나, 기판이 Z-factor53의계산과 같은 높은 처리량 스크리닝에 적합한지 여부를 결정하기 위해 추가적인 분석이 요구된다.
기판을 설계하는 한 가지 과제는 프로테아제에 의해 결합되고 인식되는 가위 결합 주위의 영역을 식별하는 것입니다. 여기에 표시된 예에서, 우리는 가위 결합을 중심으로 12 잔류 물 서열로 시작했다. 가위성 결합의 잔기 N-말단에 대한 골짜기 부위의 서열 정렬을 분석한 후 VEEV 프로테아제에 대해 발견되었으며, 반면 에 대한 ZIKV 프로테아제 상동성은 여러 C-말단 잔기로 발견되었다. 도킹된 기판의 실리코 모델은 기판의 결합 부위를 프로브하는 부위 지향 돌연변이 생성 실험을 설계하는데 사용될 수 있다. 기질 및 효소 서열이 플라스미드에 있기 때문에, 실리코 모델 또는 하위 사이트 내성에서 시험하기 위해 돌연변이될 수 있다. 이는 결합된 기판의 결정 구조를 사용할 수 없는 경우에 유리할 수 있다.
SSHHPS 분석은 또한 바이러스 유도표현형이 바이러스 효소에 의해 생성되는 기계장치에 관하여 새로운 정보를 산출할 수 있습니다. ZIKV 표적 중 하나인 SFRP1은 Wnt 신호 경로의 일부이며 뇌와 눈 발달 및 면역 반응36,37,54,55,56,57에서역할을 합니다. 우리는 ZIKV ns2B/ns3 프로테아제에 의해 절단될 수 있던 그밖 단백질 순서가 두뇌와 눈 발달에서 관련시킨 단백질에서 또한 이었다는 것을 것을을 발견했습니다; 둘 다에 있는 이상은 선천적인 Zika 증후군에서 관찰되고 바이러스 유도한 표현형58의일부인 것으로 생각됩니다.
호스트 병원체 상호 작용의 예측 가능성은 다양한 응용 프로그램에 대해 악용 될 수있다: 표적 특정 용해 바이러스 치료; 라이브 바이러스 백신의 위험 제거; 동물 모델의 정제, 예측 또는 선택; 호스트 범위 또는 감수성의 예측; 동물 유행 사건의 예측; 호스트 방어의 예측. 설명된 메서드는 시퀀스 기반이므로 나중에 소프트웨어에 통합하는 것이 좋습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 국방 위협 감소 기관 (DTRA) 프로젝트 번호 CB-SEED-SEED09-2-0061 및 CBCall4-CBM-05-2-0019에 의해 지원되었다, NCATS의 교내 / 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로, NIH (XH) 및 해군 연구소 기지 기금.
250 mL Erlenmeyer Flask | VWR | 89000-362 | |
2-mercaptoethanol | Acros Organics (Fisher) | 125472500 | Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes. |
4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap | Millipore Sigma | CLS49954L-1EA | |
AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 17-0729-01 | |
AKTA XK 16/20 Column | GE Healthcare | 28988937 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC501096 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901096 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC801024 | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | Danger: Allergic reactions (skin or breathing). |
Chelating Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0575-02 | Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer. |
Chloramphenicol | RPI | C61000 | Danger: May cause cancer. |
Corning 50 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes |
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface | Corning | 3993 | |
Dialysis Tubing Clips | Fisher Scientific | PI68011 | |
Disposable PD-10 Desalting Column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
DNAse | Sigma | DN25-1G | |
DTT (DL-Dithiothreitol) | RPI | D11000-50.0 | Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Glycerol | Acros Organics (Fisher) | 15892-0010 | |
HEPES | Millipore Sigma | H4034-1KG | |
Imidazole | Acros Organics | 301870010 | Danger: Toxic, Irritant |
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) | Calbiochem (Millipore Sigma) | 420291 | Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin. |
Laemmli Sample Buffer | BIO-RAD | 1610737 | |
Luria Bertani Agar | Fluka (Millipore Sigma) | L3027-1KG | Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds. |
Luria Bertani Media | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | |
Lysozyme | Sigma | L4919-5g | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box | BIO-RAD | ||
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Nalgene (Thermo Scientific) | 3119-0050 | |
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator | Eppendorf | M1335 | |
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | N73-500 | Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation |
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C600003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C606003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
pet15b plasmid DNA | Novagen (Millipore Sigma) | 69661 | GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates. |
pet32b | Novagen (Millipore Sigma) | 69016-3 | The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct. |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher | A32955 | Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage |
Plate Reader | Molecular Devices | Model M5 | |
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard | BIO-RAD | 161-0373 | |
Protein Extraction Reagent | Novagen (Millipore Sigma) | 70584-4 | BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher) |
Q-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0510-01 | Anion exchange resin |
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels | Expedeon | BCG01227 | Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used |
RunBlue 20x SDS Running Buffer | Expedeon | NXB50500 | Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x |
RunBlue Instant Blue Gel Stain | Expedeon | ISB1L | Do not dilute, use as directed |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271-10 | |
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator | Branson Ultrasonics (VWR) | Model No. 101-063-346R | Sonicator was used on level 5 |
Spectra/Por 6-8 kD MWCO | Spectrum Labs | 132645T | Dialysis Tubing |
SP-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0729-01 | Cation exchange resin |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T6634-500UN | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Caution: Eye/Skin Irritant |