Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula

Microglia, que representa el 5% al 10% de todas las células neuronales, son macrófagos residentes dispersos por todo el sistema nervioso central (SNC)¹. Protegida detrás de la barrera hematoencefálica, la microglia típica en un cerebro adulto sano contiene muchos procesos finos que se extienden y se retraen rápidamente para interactuar con las neuronas y otras células gliales en el parénquima. Microglia también puede adoptar la morfología amoeboides asociada con el aumento de la función fagocítica durante etapas específicas del desarrollo o ante los desafíos inmunológicos en lesiones y enfermedades^1,2,3,4. Descubrimientos emocionantes recientes han demostrado claramente que la microglia no son de ninguna manera transeúntes pasivos a señales derivadas del cerebro o patológicas, pero desempeñan un papel fundamental en el control del desarrollo cerebral y la homeostasis, por ejemplo, apoyando la supervivencia neuronal, podando sysese inmaduros, promoviendo la diferenciación de las células del linaje de oligodendrocitos, así como la angiogénesis¹. A medida que se aclaran más funciones de la microglia, la excitación se alimenta aún más de estudios de genética humana, que mostraron que muchos genes de riesgo de enfermedades neurodegenerativas, como TREM2, se expresan predominante o exclusivamente por microglia^5,6,7. Dada su importancia en el desarrollo y los roles plausibles de conducción de enfermedades, recientemente se ha hecho un enorme esfuerzo para nuestra comprensión de la regulación y función de los genes microgliales con la esperanza de encontrar nuevas dianas terapéuticas para las enfermedades neurodegenerativas^1,8.

La secuenciación de ARN (RNA-seq) permite la caracterización imparcial de la expresión génica específica del tipo de célula, que a su vez guía a los científicos para investigar las funciones genéticas en redes celulares densas^7. ARN-seq se había hecho principalmente en muestras a granel, lo que llevó al descubrimiento de una firma de genes microgliales homeostáticos que las distingue de otras células neuronales e inmunitarias^9. Sin embargo, este enfoque podría pasar por alto las diferencias moleculares y funcionales entre la microglia, especialmente las presentes transitoriamente en el desarrollo, o asociadas con el envejecimiento y la enfermedad. De hecho, el ARN-seq de una sola célula (scRNA-seq) ofrece la sensibilidad y la resolución que han revolucionado el campo al revelar la heterogeneidad previamente poco apreciada de la microglia en una variedad de contextos^2,3,10. Además, debido a la presencia de otras células inmunitarias similares en la interfaz de circulación del SNC, scRNA-seq proporciona información que ayuda al diseño de nuevas herramientas para separar y diseccionar funcionalmente estas células relacionadas con poco conocimiento previo^2,11.

Se ha inventado una amplia gama de plataformas scRNA-seq, cada una adecuada para ciertas aplicaciones¹². En general, los métodos basados en gotas, como 10x Genomics, son mayores en rendimiento con (decenas de) miles de celdas secuenciadas en cada ejecución, y son menos selectivos para la entrada que puede contener poblaciones de células mixtas que requieren una categorización amplia. Los métodos basados en placas proporcionan una mayor sensibilidad y profundidad de lectura^13,14, por lo general dirigidos a poblaciones específicas de la clasificación celular para revelar diferencias sutiles o transcripciones raras. Dado el pequeño porcentaje de células microglia, en particular las subpoblaciones asociadas al desarrollo o a la enfermedad, entre todos los tipos de células del SNC, a menudo es deseable aislar la microglia de una región específica de interés y obtener información transcriptomica profunda y completa para comprender su heterogeneidad.

Aquí, proporcionamos detalles sobre cómo aislar la microglia de diferentes regiones cerebrales de ratón diseccionadas de un solo hemisferio, que se utilizan para ARN-seq de una sola célula (o a granel) siguiendo un procedimiento de preparación de biblioteca ssemi-automatizado basado en placas. El otro hemisferio se puede utilizar para la validación histológica. Simplificado a partir de un método publicado anteriormente⁹, este protocolo de aislamiento tiene como objetivo maximizar el rendimiento de una pequeña cantidad de materiales de partida, y mientras tanto mantener perfiles de expresión génica microglial endógenos. Utilizamos la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para enriquecer la microglia (u otras células inmunitarias relacionadas de interés) en placas de 96 pocillos y miniaturizar los volúmenes de reactivos para la preparación de la biblioteca con el fin de aumentar el rendimiento. Destacamos esta plataforma sensible scRNA-seq, aunque se pueden aplicar otras estrategias basadas en placas. Este método se puede adaptar fácilmente para aislar la microglia de otros tejidos diseccionados, como lesiones o focos de enfermedad, y la edad del ratón puede variar en casi cualquier etapa postnatal. El aislamiento eficiente de la microglia regional para estudios de transcriptomica de una sola célula facilitará una mejor comprensión de sus funciones en salud y enfermedades.