Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon
Summary
Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.
Abstract
Merkezi sinir sisteminde yerleşik makrofajlar olarak, mikroglia aktif beyin gelişimi ve homeostaz kontrol, ve onların işlev bozuklukları insan hastalıkları sürücü olabilir. Homeostatik mikroglianın moleküler imzalarının yanı sıra çevresel uyaranlara yanıt olarak gen ekspresyonunda yapılan değişiklikleri ortaya çıkarmak için önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Tek hücreli genomik metodolojilerin gelişi ve olgunlaşmasıyla, heterojen mikroglianın farklı gelişimsel ve patolojik koşullarda oynadıkları çeşitli rollerin altında yattığı giderek daha fazla kabul edilmektedir. Bu tür heterojenliğin daha fazla diseksiyonu, mikroglianın belirli bir ilgi bölgesinden etkin bir şekilde izole edilmesi ve ardından tek tek hücrelerin hassas profilinin alınması yla elde edilebilir. Burada, tek bir yetişkin fare beyin yarımkürede farklı beyin bölgelerinden mikroglia hızlı izolasyon için ayrıntılı bir protokol sağlar. Ayrıca bu sıralanmış mikroglianın plaka bazlı derin tek hücreli RNA dizilimi için nasıl kullanılacağını da gösteriyoruz. Bu yöntemin diğer senaryolara uyarlanabilirliğini tartışır ve büyük ölçekli çalışmalara uyum sağlayacak şekilde sistemin iyileştirilmesi için yönergeler sağlarız.
Introduction
Tüm sinir hücrelerinin %5−%10’unu temsil eden mikroglia, merkezi sinir sistemi (CNS)1’edağılmış yerleşik makrofajlardır. Kan-beyin bariyerinin arkasında korunan, sağlıklı bir yetişkin beyin tipik mikroglia hızla genişletmek ve parankim nöronlar ve diğer glial hücreleri ile etkileşime geri birçok ince süreçler içerir. Mikroglia da belirli gelişimaşamalarında veya yaralanma ve hastalık1bağışıklık sorunları üzerine artan fagositik fonksiyon ile ilişkili amipoid morfolojisi benimseyebilir 1,2,3,4. Son heyecan verici keşifler açıkça mikroglia beyin kaynaklı veya patolojik sinyaller için pasif seyirci olduğunu göstermiştir, ama beyin gelişimi ve homeostaz kontrolünde önemli roller oynamak, örneğin, nöronal sağkalım destekleyerek, budama olgunlaşmamış sinapslar, oligodendrocyte soy hücrelerinin farklılaşması teşvik yanı sıra anjiyogenez1. Mikroglia daha fonksiyonları açıklığa kavuştururken, heyecan daha fazla insan genetik çalışmaları ile körüklenir, hangi birçok nörodejeneratif hastalık risk genleri gösterdi, TREM2 gibi, ağırlıklı olarak veya sadece microglia tarafından ifade5,6,7. Geliştirme ve makul hastalık sürüş rolleri onların önemi göz önüne alındığında, muazzam çaba son zamanlarda nörodejeneratif hastalıklar için yeni terapötik hedefler bulma umuduyla mikroglial gen regülasyonu ve fonksiyonu anlayışımıza doğru konulmuştur1,8.
RNA dizilemesi (RNA-seq) hücre tipine özgü gen ekspresyonunun tarafsız karakterizasyonuna izin verir, bu da bilim adamlarına yoğun hücresel ağlardaki gen fonksiyonlarını araştırmaya rehberlik eder7. RNA-seq çoğunlukla toplu örnekler üzerinde yapılmış, diğer nöral ve bağışıklık hücrelerinden ayıran bir homeostatik mikroglial gen imzası keşfiyol açan9. Ancak, böyle bir yaklaşım mikroglia arasındaki moleküler ve fonksiyonel farklılıkları göz ardı edebilir, özellikle de geçici olarak geliştirme mevcut, ya da yaşlanma ve hastalık ile ilişkili. Nitekim, tek hücreli RNA-seq (scRNA-seq) çeşitli bağlamlarda mikroglia daha önce az takdir heterojenlik ortaya çıkararak alanında devrim var duyarlılık ve çözünürlük sunuyor2,3,10. Buna ek olarak, CNS-dolaşım arayüzüdiğer benzer bağışıklık hücrelerinin varlığı nedeniyle, scRNA-seq çok az ön bilgi ile bu ilgili hücreleri ayırmak ve işlevsel olarak bu ilgili hücrelerin diseksiyon yeni araçların tasarımına yardımcı bilgi sağlar2,11.
ScRNA-seq platformları çeşitli bir dizi icat edilmiştir, her belirli uygulamalar için uygun12. Genel olarak, 10x Genomik gibi damlacık tabanlı yöntemler, her çalıştırmada dizili (on) binlerce hücre ile elde etme açısından daha yüksektir ve geniş kategorizasyon gerektiren karışık hücre popülasyonları içerebilecek girdi için daha az seçicidir. Plaka tabanlı yöntemler daha yüksek duyarlılık sağlamak ve derinliği13okumak,14, genellikle ince farklılıklar veya nadir transkript ortaya çıkarmak için hücre sıralama belirli popülasyonları hedefleme. Mikroglial hücrelerin küçük yüzdesi göz önüne alındığında, özellikle bu gelişme- veya hastalık la ilişkili alt popülasyonlar, tüm CNS hücre tipleri arasında, genellikle ilgi belirli bir bölgeden mikroglia izole etmek ve onların heterojenlik anlamak için derin ve tam uzunlukta transkripsiyonik bilgi elde etmek için arzu edilir.
Burada, yarı otomatik plaka tabanlı kütüphane hazırlama prosedürü nden sonra tek hücreli (veya toplu) RNA-seq için kullanılan tek bir yarımküreden parçalanmış farklı fare beyin bölgelerinden mikroglia izole etmek için nasıl ayrıntıları sağlar. Diğer yarımküre daha sonra histolojik doğrulama için kullanılabilir. Daha önce yayınlanmış bir yöntem9aerodinamik, Bu izolasyon protokolü başlangıç malzemelerin in verimi maksimize etmeyi amaçlamaktadır, ve bu arada endojen mikroglial gen ekspresyonu profilleri korumak. Mikrogliayı (veya diğer ilgili bağışıklık hücrelerini) 96 kuyuplakaya dönüştürmek ve üretim hacmini artırmak için kitaplık hazırlama için reaktif lerin hacimlerini minyatürleştirmek için floresan tarafından aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanıyoruz. Diğer plaka tabanlı stratejiler uygulansa da bu hassas scRNA-seq platformuna vurgu yapıyoruz. Bu yöntem, mikroglia’yı yaralanma veya hastalık odakları gibi diğer diseksiyon lu dokulardan izole etmek için kolayca uyarlanabilir ve farenin yaşı hemen hemen her doğum sonrası evreye kadar değişebilir. Tek hücreli transkripsiyon çalışmaları için bölgesel mikrogliaverimli izolasyon sağlık ve hastalık fonksiyonlarının daha iyi anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroglia aktif CNS diğer hücre tipleri ile etkileşim, ve çevresel uyaranlara çok duyarlıdır. İzolasyon işlemi sırasında gen ekspresyonundaki inflamatuar yanıtları ve anormal değişiklikleri en aza indirmek için, bu protokol daha önce yayınlanmış bir yöntem9’dandüzene sokulmuştur ve artık mikroglia’yı tek bir fare beyninin birçok bölgesinden paralel olarak izole etmek uygundur. Dokular ve reaktifler soğuk sıcaklıkta tutulur ve sınırlı doku boyutlarına göre daha az…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno ve Spyros Darmanis’e bu protokolün geliştirilmesi sırasında ki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca Stanford Paylaşılan FACS Tesisi, özellikle Meredith Weglarz ve Lisa Nichols teşekkür ederiz; Yen Tran, Michael Eckart Stanford Protein ve Nükleik Asit Tesisi (PAN) filme için büyük destek için. Bu çalışma JPB Vakfı ve Vincent J. Coates Vakfı tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' – AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | |
References
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
- Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer’s Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
- Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
- Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer’s disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).
- Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), 79-89 (2018).
