Изоляция региона конкретных микроглии от одного взрослого полушария мозга мыши для глубокой одноклеточной РНК секвенирования

Микроглия, представляющая 5%-10% всех нервных клеток, являются резидентными макрофагами, разбросанными по всей центральной нервной системе (ЦНС)¹. Защищенный за гематоэнцефалии барьер, типичные микроглии в здоровом мозге взрослого содержат много тонких процессов, которые быстро продлить и втягивать взаимодействовать с нейронами и другими глиальными клетками в parenchyma. Микроглия может также принять амебоидной морфологии, связанные с увеличением фагоцитарной функции на конкретных стадиях развития или на иммунные проблемы при травме и болезни^1,2,3,4. Недавние захватывающие открытия ясно показали, что микроглии ни в коем случае не являются пассивными наблюдателями к мозгу полученных или патологических сигналов, но играют ключевую роль в контроле развития мозга и гомеостаза, например, поддерживая выживание нейронов, обрезка незрелых синапсов, содействие дифференциации линий олигодендроцитов, а также ангиогенез¹. По мере того как больше функций микроглии выяснены, возбуждение более далее подпитывается людскими исследованиями генетики, которые показали что много нейродегенеративных генов риска заболевания, such as TREM2, большей частью или исключительн выражено микроглией^5,6,7. . Учитывая их значение в развитии и правдоподобные болезни вождения роли, огромные усилия были направлены на наше понимание микроглиальной регуляции генов и функции в надежде найти новые терапевтические цели для нейродегенеративных заболеваний^1,8.

Секвенирование РНК (РНК-сек) позволяет объективно охарактеризовать экспрессию генов типа клеток, что, в свою очередь, направляет ученых к изучению функций генов в плотных клеточных сетях^7. РНК-сек в основном было сделано на массовых образцов, что привело к открытию гомеостатической микроглиальной подписи гена, который отличает их от других нервных и иммунных клеток⁹. Однако такой подход может упускать из виду молекулярные и функциональные различия между микроглией, особенно те, которые временно присутствуют в процессе развития, или связанные со старением и болезнями. Действительно, одноклеточный РНК-сек (scRNA-seq) предлагает чувствительность и разрешение, которые произвели революцию в этой области, выявив ранее недооцененную неоднородность микроглии в различных контекстах^2,3,10. Кроме того, в связи с наличием других аналогичных иммунных клеток на цНС-циркуляции интерфейса, scRNA-seq предоставляет информацию, помогающую дизайн новых инструментов для разделения и функционально вскрыть эти связанные клетки с небольшим ипредварительных знаний^2,11.

Был изобретен разнообразный набор платформ scRNA-seq, каждая из которых подходит для определенных приложений^12. В целом, методы на основе капель, такие как 10x геномика, выше пропускной связи с (десятки) тысячи клеток последовательной в каждом запуске, и они менее избирательны для ввода, которые могут содержать смешанные популяции клеток, требующих широкой классификации. Методы на основе плит обеспечивают более высокую чувствительность и глубину чтения^13,14, как правило, ориентации конкретных популяций от сортировки клеток, чтобы выявить тонкие различия или редкие стенограммы. Учитывая небольшой процент микроглиальных клеток, особенно субпопуляций, связанных с развитием или болезнями, среди всех типов клеток ЦНС, часто желательно изолировать микроглию от конкретной области, интересуемых, и получить глубокую и полноформатную транскриптомическую информацию, с тем чтобы понять их неоднородность.

Здесь мы предоставляем подробную информацию о том, как изолировать микроглии из различных областей мозга мыши расчленены из одного полушария, которые используются для одноклеточных (или объемных) РНК-сек после полуавтоматической пластины на основе процедуры подготовки библиотеки. Другое полушарие может быть использовано для гистологической проверки. Оптимизированный из ранее опубликованного метода^9,этот протокол изоляции направлен на максимизацию выхода от небольшого количества исходных материалов, а тем временем поддерживать эндогенные профили экспрессии микроглиальных генов. Мы используем флуоресценцию активированных клеток сортировки (FACS) для обогащения микроглии (или других связанных иммунных клеток, представляющих интерес) в 96-колодных пластин и миниатюризации объемов реагентов для подготовки библиотеки для того, чтобы увеличить пропускную способность. Мы выделяем эту чувствительную платформу scRNA-seq, хотя могут быть применены и другие стратегии на основе пластин. Этот метод может быть легко адаптирован для изоляции микроглии от других расчлененных тканей, таких как травмы или заболевания очагов, и возраст мыши может варьироваться практически на всех послеродовых стадиях. Эффективная изоляция региональной микроглии для одноклеточных исследований транскриптомики будет способствовать лучшему пониманию их функций в области здравоохранения и болезней.