깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

모든 신경 세포의 5%-10%를 나타내는 Microglia는 중추 신경계 (CNS)^1에걸쳐 흩어져 있는 상주 대식세포입니다. 혈액-뇌 장벽 뒤에 보호, 건강 한 성인 두뇌에 전형적인 microglia 신속 하 게 확장 하 고 천골에서 신경 세포와 상호 작용 하는 후퇴 많은 미세 한 프로세스를 포함. Microglia는 또한 특정 발달 단계 도중 증가된 식세포 기능과 관련되었던 amoeboid 형태를 채택할 수 있습니다 또는 상해와 질병에 있는 면역 도전에^1,2,3,4. 최근의 흥미로운 발견은 microglia가 뇌 유래 또는 병리학 적 신호에 결코 수동적인 방관자가 아니라, 예를 들어, 신경 생존을 지원하고, 미성숙 시냅스를 가지치기, 올리고벤드로크세포 세포 분화를 촉진하고, 혈관신생^1을촉진함으로써 뇌 발달 및 항상성 조절에 중추적인 역할을 한다는 것을 분명히 입증하였다. microglia의 더 많은 기능이 해명됨에 따라, 흥분은 TREM2와 같은 많은 신경 퇴행성 질환 위험 유전자가 주로 또는 독점적으로 마이크로 글리아^5,6,7에의해 표현된다는 것을 보여주었던 인간 유전학 연구에 의해 더욱 촉진됩니다. 발달과 그럴듯한 질병 구동 역할에 있어서 의의를 감안할 때, 최근 신경퇴행성 질환에 대한 새로운 치료 표적을 찾기 위해 미세교세포 유전자 조절 및 기능에 대한 이해를 위해 엄청난 노력이 투입되고^있다1,8.

RNA 시퀀싱 (RNA-seq)은 세포 유형 별 유전자 발현의 편견없는 특성화를 허용하며, 이는 차례로 조밀한 세포 네트워크에서 유전자 기능을 조사하는 과학자를^{안내합니다 7.} RNA-seq는 주로 대량 샘플에서 이루어졌으며, 다른 신경 및 면역 세포와 구별되는 항상성 미세 교만 유전자 시그니처의 발견으로^{이어졌습니다 9.} 그러나, 이러한 접근은 microglia 사이 분자와 기능적인 다름을 간과할 수 있었습니다, 특히 그 개발에 일시적으로 나타나거나, 노화와 질병과 관련되었던. 실제로, 단세포 RNA-seq(scRNA-seq)는 다양한 문맥^2,3,10에서이전에 과소평가된 마이크로글리아의 이질성을 밝혀냄으로써 분야에 혁명을 일으켰던 감도 및 분해능을 제공한다. 또한, CNS 순환 계면에서 다른 유사한 면역 세포의 존재로 인해, scRNA-seq는 이러한 관련 세포를 거의 사전 지식 없이 분리하고 기능적으로 해부하는 새로운 도구의 설계를 돕는 정보를 제공한다^2,11.

scRNA-seq 플랫폼의 다양한 배열이 발명되었으며, 각각 특정 애플리케이션^12에적합합니다. 일반적으로, 10x 유전체학과 같은 액적 기반 방법은 각 실행에서 시퀀싱된 수천 개의 셀을 통해 처리량이 더 높으며, 광범위한 분류를 필요로 하는 혼합 된 세포 집단을 포함할 수 있는 입력에 대해 덜 선택적입니다. 플레이트 기반 방법은 더 높은 감도및 읽기 깊이^13,14를제공하며, 일반적으로 세포 분류로부터 특정 집단을 타겟팅하여 미묘한 차이 또는 희귀 한 성적 증명서를 밝힙니다. microglial 세포의 작은 백분율을 감안할 때, 특히 그 발달- 또는 질병 관련 하위 집단, 모든 CNS 세포 모형 중, 관심있는 특정 지역에서 microglia를 격리하고 그들의 이질성을 이해하기 위하여 깊고 전체 길이 전사체 정보를 얻는 것이 바람직하다.

여기서, 우리는 반자동 플레이트 기반 라이브러리 준비 절차에 따라 단일 세포 (또는 대량) RNA-seq에 사용되는 단일 반구에서 해부된 다른 마우스 뇌 영역에서 microglia를 분리하는 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다. 그런 다음 다른 반구를 조직학적 유효성 검사에 사용할 수 있습니다. 이전에 공표된 방법^9로부터간소화된 이 절연 프로토콜은 소량의 시작 물질로부터 수율을 최대화하고, 한편 내인성 미세교유전자 발현 프로파일을 유지하는 것을 목표로 한다. 우리는 형광 활성화 세포 선별 (FACS)을 사용하여 마이크로 글리아 (또는 기타 관련 면역 세포)를 96 웰 플레이트로 풍부하게하고 처리량을 높이기 위해 라이브러리 준비를위한 시약의 양을 소형화합니다. 우리는 다른 플레이트 기반 전략이 적용될 수 있더라도, 이 민감한 scRNA-seq 플래트홈을 강조합니다. 이 방법은 상해 또는 질병 초점과 같은 다른 해부 된 조직에서 microglia를 쉽게 분리하도록 쉽게 적응 할 수 있으며 마우스의 나이는 거의 모든 출생 후 단계에 따라 다를 수 있습니다. 단세포 전사체 연구를 위한 국소 microglia의 능률적인 격리는 건강과 질병에 있는 그들의 기능의 더 나은 이해를 촉진할 것입니다.