הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

תאי האנדותל יוצרים את הציפוי של כלי הדם ומתווכים בתפקודים חשובים הכוללים תחזוקה של חדירות הקיר, רגולציה של זרימת הדם, צבירת טסיות דם והיווצרות כלי דם חדשים. במוח, תאי האנדותל מהווים חלק ממכשול מוחי קריטי ששולט בחוזקה על חילופי חומרים בין המוח לבין מחזור הדם¹. המחקרים שלנו בעשור האחרון זיהו תפקידים נוירוגניים הרומן של תאים אנדותל המוח כי יש השלכות משמעותיות על התפתחות המוח והתנהגות^2,3,4,5. הראינו כי העכבר מתחלקים מראש המוח הוא vascularized על ידי שני סוגי המשנה ברורים של כלי, כלי הקיבול ואת כלי הקיבול, כי שונים באנטומיה, מקור, ופרופיל התפתחותי². תאים אנדותל בטנה תת אלה שני כלי הקיבול להראות הבדלים שונים פרופילים גנים שלהם ביטוי. בעוד בתאי האנדותל המהירה ביותר לבטא גנים הקשורים דלקת ותגובה חיסונית, תאים אנדותל המוח מועשר באופן ייחודי ביטוי של גנים הקשורים בדרך כלל נוירוגנזה, הגירה עצבית, כימוטווניות, ו אקסון הדרכה³. תאים המוח הבין-חדרית גם הבית הספר מסלול מאותת הרומן, כי הוא נבדל מתוך מסורתית עצביים המסורתית נגבה מסלול⁵. במקביל עם הביטוי הגנטי שלה, תאי האנדותל החדרית נמצאו כדי לווסת הגירה והפצה של הביננוירונים GABAergic בקליפת המוח המתפתח. במהלך פיתוח עובריים, תאי האנדותל החדרית עוברים הגירה למרחקים ארוכים לאורך מעבר-הדרגתי של הבנגאני-על כדי להקים את רשת כלי הדם הפריחדרית^2,3. מסלול נדידה זה משתקף יום מאוחר יותר על ידי האינטרנוירונים. הגירה האינטרנוירונים אינטראקציה גופנית עם הרשת מראש בנוי כלי דם periventricular ולהשתמש בו כמו מחבל להגיע ליעד הסופי שלהם בקליפת המוח. בנוסף למשחק כמצע פיזי, תאי האנדותל החדרית משמשים כמקור לאותות הניווט לצורך העברת נוירונים. מדריכי הגירה של התאים הבין-מנחים להגירה ומסדיר את דפוסי ההפצה הסופיים⁴. פגמים בהגירה והפצה משויכים להפרעות נוירופסיכיאטריות כגון אוטיזם, אפילפסיה, סכיזופרניה ודיכאון^6,7,8,9,10. לכן, לימוד של פונקציות תא אנדותל המוח והשפעתם על הגירה הבין-תאית בהקשר האנושי הופך קריטי לטיפול בפתוגנזה של הפרעות אלה.

יצרנו תאים אנושיים בעלי כדוריות המוח האנטי-חדרית מתאי גזע עובריים אנושיים במעבדה שלנו¹¹, באמצעות תא גזע המושרה pluriפוטנטי (ipsc) טכנולוגיה^12,13. כדי לאמת אם תאי הגוף האנושי הפריבאלי מחקים בנאמנות את תאי האנטי-בתים של העכבר, ועל מנת לאמוד את השפעתם על הגירה בין-חדרית, פיתחנו שלושה בתוך מבחנה: שיטת הגירה ארוכת שנים, שיטת הגירה של תרבות שותפה, ושיטת הכימותרפיה-אטרקציה. כאן אנו מתארים פרוטוקולים עבור אלה שאומר בפרוטרוט. כל שלושת התוספות מבוססים על השימוש בתוספים לתרבות הסיליקון כדי ליצור טלאי מלבני קטן של תאים (של ממדים קבועים) מוקפים בשטח נטול תאים. מרחק ההעברה מוערך על-ידי מדידת המרחק בין המיקומים הסופיים של תאים מהגבול של התיקון המלבני שהותווה ביום 0. בתוך שיטת ההגירה ארוכת הטווח, תאי האנדותל האנושיים הקיימים מתפעינים כטלאי במרכז המנה 35 מ”מ, והמרחקים שבהם התאים מחושבים במשך זמן ארוך. בשנת שיתוף תרבות הגירה התיקון, תאים אנושיים המוח האנושי שיתוף הזרע עם interneurons אנושיים כמו תיקון אחד בצלחת 35 mm. התקנה זו מאפשרת בדיקה של ההשפעה של אינטראקציות פיזיות ישירות של שני סוגי תאים אלה על שיעור ההגירה של האינטרנוירונים. שיטת הכימותרפיה-אטרקציה מודדת את הגירה של האינטרנוירונים בתגובה לרמזים אטרקטיביים לכימותרפיה המופרשים על-ידי תאי האנדותל האנושיים. האינטרנוירונים הם שנזרע כטלאי מלבני, עם תאי האדם הפריתאלי האנושי ושליטה בתאי האנדותל שאינם הפריקיים שנזרע כטלאים בגודל דומה בכל צד. כל אחד מתיקוני התא מופרדים על-ידי פער ללא תא של 500 μm. תגובה של האינטרנוירונים מוערך על ידי כימות מספר התאים שהועברו לעבר תאים אנדותל החדרית לעומת שליטה בתאי אנדותל שאינם הפריחדרית.

הספק האלה מספקים הערכה איתנה של פונקציות התא האנושי הפריציאלי והשפעתם על הגירה בין-תאית. כיוונון הרומן של שיטת העברת היקף ושיתוף תרבות בינעירוניות מספק שטח פנוי לתא בטווח סנטימטרים (~ 1-1.5 ס מ) כדי לאפשר זיהוי של הגירה למרחקים ארוכים. סיכום של התכונות של בחני שלנו לעומת הפופולרי אחרים בחני מוצגת בטבלה 1. באופן קולקטיבי, בחני המתואר כאן ישמש פלטפורמה להערכת “חולה” תאים אנדותל המוח הביננוירונים שנוצר מ iPSCs של הפרעות בראש כמו סכיזופרניה, אוטיזם או אפילפסיה. מספר זה יכול לשמש גם כדי לקבוע כיצד תנאים שונים (למשל, מעכבי, ליגנדס, RNAi) משפיעים על העברת תאים. לבסוף, מספר זה יכול להיות ממוטב עבור סוגי תאים אחרים כדי למדוד הגירה למרחקים ארוכים, כימותרפיה-הגירה או תא התא ההגירה מתווכת.