Миграция, химиотерапия, и совместно-культурные анализы для стволовых клеток человека, полученных эндотелиальных клеток и ГАМК нейронов

Эндотелиальные клетки образуют слизистую оболочку кровеносных сосудов и посредничают в важных функциях, которые включают поддержание проницаемости стенки сосудов, регуляцию кровотока, агрегацию тромбоцитов и образование новых кровеносных сосудов. В головном мозге эндотелиальные клетки являются частью критического гематоэнцефалического барьера, который жестко контролирует обмен материалами между мозгом и кровотоком^1. Наши исследования в последнее десятилетие определили новые нейрогенные роли эндотелиальных клеток мозга, которые имеют значительные последствия для развития мозга и поведения^2,3,4,5. Мы показали, что мышь эмбрионального переднего мозга васкуляризовано двумя различными подтипами сосудов, pial сосудов и перивентрикулярных сосудов, которые отличаются по анатомии, происхождению и развития профиля². Эндотелиальные клетки, выстилающие эти два подтипа сосуда, показывают явные различия в профилях экспрессии генов. В то время как pial эндотелиальные клетки в основном выражают гены, связанные с воспалением и иммунным ответом, перивентрикулярные эндотелиальные клетки однозначно обогащены экспрессией генов, обычно связанных с нейрогенезом, нейрональной миграцией, хемотаксисом и аксоном^3. Перивентрикулярные эндотелиальные клетки также дом роман ГАМК сигнальный путь, который отличается от традиционных нейрональных ГАМК сигнализации пути⁵. Сопутствуя экспрессии гена, перивентрикулярные эндотелиальные клетки были найдены для регулирования миграции и распределения ГАМК-интернейронов в развивающихся неокортекс. Во время эмбрионального развития, перивентрикулярные эндотелиальные клетки проходят междугородную миграцию вдоль брюшно-дорсального градиента для установления перивентрикулярной сосудистой сети^2,3. Этот миграционный маршрут отражается на следующий день interneurons. Мигрирующие интернейроны физически взаимодействуют с заранее сформированной перивентрикулярной сосудистой сетью и используют ее в качестве путеводителя для достижения конечного пункта назначения в неокортексе. В дополнение к действуя в качестве физического субстрата, перивентрикулярные эндотелиальные клетки служат источником навигационных сигналов для мигрирующих нейронов. Перивентрикулярный эндотелиальной клеточной секретной ГАМК направляет интернерон миграции и регулирует их окончательное распределение моделей⁴. Дефекты в интернеронной миграции и распределении связаны с нейропсихиатрическими расстройствами, такими как аутизм, эпилепсия, шизофрения и депрессия^6,7,8,9,10. Таким образом, изучение перивентрикулярных эндотелиальных клеточных функций и их влияние на межжелудочковую миграцию в человеческом контексте становится критическиважным для решения патогенеза этих расстройств.

Мы создали человека перивентрикулярных, как эндотелиальные клетки из человеческих эмбриональных стволовых клеток в нашей лаборатории¹¹, используя индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) технология^12,13. Чтобы проверить, имитируют ли человеческие перивентрикулярные эндотелиальные клетки, верно имитируют мышиные перивентрикулярные эндотелиальные клетки, и количественно оценить их влияние на миграцию интернеров, мы разработали три анализы in vitro: анализ миграции на расстоянии, анализ миграции между культурой и анализ хемо-притяжения. Здесь мы подробно описываем протоколы этих анализов. Все три анализы основаны на использовании силиконовой культуры вставки для создания небольшой прямоугольный участок клеток (фиксированных размеров) в окружении клеточного пространства. Расстояние миграции оценивается путем измерения расстояния между конечными позициями ячеек от границы прямоугольного пятна, которое было изложено в день 0. В ходе дальнего анализа миграции человеческие перивентрикулярные эндотелиальные клетки засеиваются в виде пластыря в центре 35-мм тарелки, и рассчитываются расстояния, пройденные клетками в течение длительного времени. В исследовании миграции сокультуры, человеческие перивентрикулярные эндотелиальные клетки со-сеяные с человеческими интернейронами, как один патч в 35-мм блюдо. Эта установка позволяет изучить влияние прямых физических взаимодействий этих двух типов клеток на скорость миграции интернейронов. Химио-притяжения асссеизмерия измеряет миграцию интернейронов в ответ на химио-привлекательные сигналы, выделяемые перивентрикулярными эндотелиальными клетками человека. Interneurons посеяны как прямоугольный патч, с человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток и контроля не-перивентрикулярных эндотелиальных клеток, посеянных как аналогичные размеры патчи с обеих сторон. Каждый из ячеек патчи разделены клеточной свободной разрыв 500 мкм. Реакция межнейронов оценивается путем количественной оценки числа клеток, которые мигрировали в перивентрикулярных эндотелиальных клеток по сравнению с контролем неперивентрикулярных эндотелиальных клеток.

Эти анализы обеспечивают надежную оценку человеческих перивентрикулярных эндотелиальных клеточных функций и их влияния на интернеронную миграцию. Новая установка дальнего анализа и совместной культуры миграции анализ обеспечивает ячейки свободного пространства в диапазоне сантиметров (1-1,5 см), чтобы позволить обнаружение междугородной миграции. Краткое изложение особенностей наших анализов по сравнению с другими популярными анализами представлено в таблице 1. В совокупности, анализы, описанные здесь будет служить в качестве платформы для оценки “болезненных” перивентрикулярных эндотелиальных клеток и интернейронов, порожденных iPSCs расстройств головного мозга, как шизофрения, аутизм или эпилепсия. Эти анализы также могут быть использованы для определения того, как различные условия (например, ингибиторы, лиганды, РНК) влияют на миграцию клеток. Наконец, эти анализы могут быть оптимизированы для других типов клеток для измерения междугородной миграции, химиотерапии-притяжения или опосредоченной миграции клеток.