Мульти-Волокно Фотометрия для записи нейронной активности в свободно движущихся животных
Summary
В этом протоколе подробно описано, как осуществлять и выполнять многоволоконные фотометрические записи, как исправить для независях от кальция артефактов, а также важные соображения для двухцветной фотометрической визуализации.
Abstract
Запись активности группы нейронов в свободно движущемся животном является сложной задачей. Кроме того, по мере того, как мозг расчленяется на все более мелкие и малые функциональные подгруппы, запись по проекциям и/или генетически определенным субпопуляциям нейронов становится первостепенной. Волоконная фотометрия является доступным и мощным подходом, который может преодолеть эти проблемы. Объединив оптические и генетические методологии, нейронная активность может быть измерена в глубоких структурах мозга путем выражения генетически закодированных индикаторов кальция, которые преобразуют нейронную активность в оптический сигнал, который можно легко измерить. Текущий протокол детализирует компоненты многоволоконной системы фотометрии, как получить доступ к глубоким структурам мозга для доставки и сбора света, метод учета артефактов движения, и как обрабатывать и анализировать флуоресцентные сигналы. Протокол детализирует экспериментальные соображения при выполнении одно- и двойной цветизображения, от одного или нескольких имплантированных оптических волокон.
Introduction
Способность соотносить нейронные реакции с определенными аспектами поведения животного имеет решающее значение для понимания роли конкретной группы нейронов играет в режиссуре или реагировании на действие или стимул. Учитывая сложность поведения животных, с множеством внутренних состояний и внешних стимулов, которые могут повлиять даже на простейшие действия, запись сигнала с односудебным разрешением оснащает исследователей необходимыми инструментами для преодоления этих Ограничения.
Волоконная фотометрия стала методом выбора для многих исследователей в области системной нейронауки из-за его относительной простоты по сравнению с другими методами записи in vivo, его высоким соотношением сигнала к шуму, а также способностью записываться в различных поведенческие парадигмы1,2,3,4,5,6,7,8. В отличие от традиционных электрофизиологических методов, фотометрия является оптическим подходом, наиболее часто используемым в сочетании с генетически закодированными индикаторами кальция (GECIs, серия GCaMP)9. ГИКи меняют свою способность к флуоресцизму в зависимости от того, связаны ли они с кальцием. Потому что внутренняя концентрация кальция в нейронах очень жестко регулируется и напряжения-gated кальциевых каналов открыты, когда нейрон пожаров потенциал действия, переходное увеличение внутренней концентрации кальция, что приводит к переходным увеличениям в способность GECI к флуоресценции, может быть хорошим прокси для нейронов стрельбы9.
С помощью волоконной фотометрии, возбуждая свет направлен вниз тонкой, многопользовательской оптической волокна в мозг, и сигнал выбросов собирается обратно через то же волокно. Поскольку эти оптические волокна легкие и сгибаемые, животное может двигаться в основном беспрепятственно, что делает этот метод совместимым с широким спектром поведенческих тестов и условий. Некоторые условия, такие как быстрые движения или изгиб волоконно-оптического патча шнур за радиус, в котором он может поддерживать общее внутреннее отражение, может ввести сигнал артефактов. Чтобы дизабигват сигнал от шума, мы можем использовать свойство GCaMP известный как “изосбестной точки”. Кратко, с GCaMP, по мере того как длина волны света возбуждения перенесена к левой стороне, своя излучение в кальцием-связанном положении уменьшает и излучение в кальцием-unbound положении незначительно увеличивает. Точка, в которой относительная интенсивность этих двух выбросов равна, называется изосбестной точкой. Когда GCaMP возбужденных в этот момент, его выброс не влияет на изменения во внутренних концентрациях кальция, и дисперсия в сигнале чаще всего из-за затмения сигнала от overbending волоконно-оптического патча шнура или движения нервной ткани по отношению к имплантированному волокну.
Одноединая единица электрофизиологии по-прежнему является золотым стандартом для свободно движущихся записей in vivo из-за его одноклеточного и однопикового разрешения уровня. Тем не менее, это может быть трудно определить молекулярной идентичности клеток, регистрируются, и после специального анализа может быть довольно трудоемким. Хотя волоконная фотометрия не имеет одноклеточного разрешения, она позволяет исследователям задавать вопросы, которые невозможно решить с помощью традиционных методов. Сочетание вирусных стратегий с трансгенными животными, экспрессия ГГИС может быть направлена на генетически определенные типы нейронов для записи популяционно-или проекционно-определенной нейронной активности, которая может быть выполнена путем мониторинга сигнала кальция непосредственно на аксон терминалы10,11. Кроме того, имплантируя несколько волоконно-оптических канюли, можно одновременно контролировать нейронную активность из нескольких областей мозга и путей в одном животном12,13.
В этой рукописи мы описываем технику одно- и многоволоконной фотометрии, как исправить для независях от кальция артефактов, и подробно, как выполнять моно- и двухцветные записи. Мы также приведив примеры типов вопросов, которые он позволяет задать и их возрастающие уровни сложности (см. рисунок 1). Установка фотометрии волокна для многоволоконных записей, описанных в этом протоколе, может быть построена с помощью списка материалов, найденных на https://sites.google.com/view/multifp/hardware(рисунок 2).
Важно, чтобы система была оборудована как для 410 нм и 470 нм возбуждающие длины волн для кальция-независимых и кальциевых зависимых флуоресценции выбросов от GCaMP6 или его вариантов. Для пользовательских настроек или если нет доступного программного обеспечения для запуска системы, можно использовать бесплатную программу bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) с открытым исходным кодом. Кроме того, волоконная фотометрия может проходить через MATLAB (например, https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 или другой язык программирования14. Программное и аппаратное обеспечение системы должно позволить манипулировать как 410 нм и 470 нм светодиодов и камеры, извлечение изображений (Рисунок 2), и расчет средней интенсивности флуоресцентных в регионах интереса (ROIs) обращается вокруг волокон на изображения. Выход должен быть таблицей значений средней интенсивности, записанных с 470 нм и 410 нм светодиодов от каждого волокна в патч шнур. При выполнении многоволоконных экспериментов, 400 мкм в комплекте волокон может ограничить движение мышей. В таких случаях мы рекомендуем использовать 200 мкм патч шнуры, которые обеспечивают большую гибкость. Это также может быть возможным использовать меньшие манекен кабели во время тренировки мышей.
Очень важно, чтобы иметь возможность извлечь очки времени для событий, представляющих интерес во время приобретения волоконной фотометрии. Если система не обеспечивает встроенную систему для интеграции TTL для конкретных событий, альтернативная стратегия заключается в присвоении отметки времени отдельным точкам времени, записанным в соответствие с конкретнымвременем и событиями в ходе эксперимента. Штамповка времени может быть выполнена с помощью компьютерных часов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Фотометрия клетчатки является доступным подходом, который позволяет исследователям записывать динамику навалом кальция из определенных нейронных популяций у свободно движущихся животных. Этот метод может быть объединен с широким спектром поведенческих тестов, в том числе “движение …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC: RGPIN-2017-06131) к К.П. К.П. является ФСК Чрчер-Бурсье. Мы также благодарим Plateforme d’Outils Mol’culaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) за производство вирусных векторов, используемых в данном исследовании.
Materials
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long | Thorlabs | SH25S100 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long | Thorlabs | SH25S050 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long | Thorlabs | SH25S038 | |
| 1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs | M59L01 | |
| 12.7 mm Optical Post | Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm Pedestal Post Holder | Thorlabs | PH20EM | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube | Thorlabs | KPS101 | |
| 20x objective | Thorlabs | RMS20X | #10 in Figure 2, #11 in Figure 5 |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs | CM1-DCH/M | #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5 |
| 405 nm LED | Doric Lenses | CLED_405 | #2 in Figure 2 |
| 410 nm bandpass filter | Thorlabs | FB410-10 | #5 in Figure 2; #7 in Figure 5 |
| 465 nm. LED | Doric Lenses | CLED_465 | #1 in Figure 2 |
| 470 nm bandpass filter | Thorlabs | FB470-10 | #4 in Figure 2; #6 in Figure 5 |
| 560 nm bandpass filter | Semrock | FF01-560/14-25 | #5 in Figure 5 |
| 560 nm LED | Doric Lenses | CLED_560 | #1 in Figure 3 |
| 5-axis kinematic Mount | Thorlabs | K5X1 | #11 in Figure 2, #12 in Figure 5 |
| Achromatic Doublet | Thorlabs | AC254-035-A-ML | #7 in Figure 2 |
| Adaptor for 405 collimator | Thorlabs | AD11F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Adaptor for ajustable collimator | Thorlabs | AD127-F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB1824 | |
| Clamping Fork | Thorlabs | CF125 | |
| Cube connector | Thorlabs | CM1-CC | |
| Dual 493/574 dichroic | Semrock | FF493/574-Di01-25×36 | #10 in Figure 5 |
| Emission filter for GCaMP6 | Semrock | FF01-535/22-25 | #6 in Figure 2 |
| Enclosure with Black Hardboard Panels | Thorlabs | XE25C9 | |
| Externally SM1-Threaded End Cap for Machining | Thorlabs | SM1CP2M | |
| Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder | Thorlabs | SM1QP | #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5 |
| Fixed Collimator for 405 nm light | Thorlabs | F671SMA-405 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Fixed collimator for 470 and 560 nm light | Thorlabs | F240SMA-532 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Green emission filter | Semrock | FF01-520/35-25 | In light beam splitter |
| High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera | Thorlabs | DCC3260M | #13 in Figure 2, #15 in Figure 5 |
| Light beam splitter | Neurophotometrics | SPLIT | #14 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff | Thorlabs | DMLP425R | #8 in Figure 2, #9 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff | Semrock | FF495-Di03 | #9 in Figure 2, #8 in Figure 5 |
| Metabond dental cement | C&B | ||
| M8 – M8 cable | Doric Lenses | Cable_M8-M8 | |
| Optic fiber cannulas | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Optic fiber Patchcords | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Red emission filter | Semrock | FF01-600/37-25 | In light beam splitter |
| T7 LabJack | LabJack | ||
| T-cube LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 | Thorlabs | CAB-DCU-T3 |
References
- Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
- Proulx, C. D., et al. A neural pathway controlling motivation to exert effort. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (22), 5792-5797 (2018).
- Muir, J., et al. In Vivo Fiber Photometry Reveals Signature of Future Stress Susceptibility in Nucleus Accumbens. Neuropsychopharmacology. 43 (2), 255-263 (2017).
- Wang, D., et al. Learning shapes the aversion and reward responses of lateral habenula neurons. eLife. 6, (2017).
- de Jong, J. W., et al. A Neural Circuit Mechanism for Encoding Aversive Stimuli in the Mesolimbic Dopamine System. Neuron. 101 (1), 133-151 (2018).
- Lerner, T. N., et al. Intact-Brain Analyses Reveal Distinct Information Carried by SNc Dopamine Subcircuits. Cell. 162 (3), 635-647 (2015).
- Calipari, E. S., et al. In vivo imaging identifies temporal signature of D1 and D2 medium spiny neurons in cocaine reward. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2726-2731 (2016).
- González, A. J., et al. Inhibitory Interplay between Orexin Neurons and Eating. Current Biology. 26 (18), 2486-2491 (2016).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
- Siciliano, C. A., Tye, K. M. Leveraging calcium imaging to illuminate circuit dysfunction in addiction. Alcohol. 74, 47-63 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
- Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
- Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Scientific Reports. 9 (1), 3521 (2019).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocol. 7 (1), 12-23 (2011).
- Stamatakis, A. M., et al. Lateral Hypothalamic Area Glutamatergic Neurons and Their Projections to the Lateral Habenula Regulate Feeding and Reward. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 302-311 (2016).
- Tervo, G. D., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Yu, K., da Silva, P., Albeanu, D. F., Li, B. Central Amygdala Somatostatin Neurons Gate Passive and Active Defensive Behaviors. The Journal of Neuroscience. 36 (24), 6488-6496 (2016).
- Falkner, A. L., Grosenick, L., Davidson, T. J., Deisseroth, K., Lin, D. Hypothalamic control of male aggression-seeking behavior. Nature Neuroscience. 19 (4), 596-604 (2016).
- Ren, J., et al. Anatomically Defined and Functionally Distinct Dorsal Raphe Serotonin Sub-systems. Cell. 175 (2), 472-487 (2018).
- Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLOS ONE. 12 (2), 0170934 (2017).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), (2018).
- Feng, J., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Detection of Norepinephrine. Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
- Wang, H., Jing, M., Li, Y. Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators. Current Opinion in Neurobiology. 50, 171-178 (2018).
- Lu, L., et al. Wireless optoelectronic photometers for monitoring neuronal dynamics in the deep brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1374-1383 (2018).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing Hypothalamic Network Dynamics for Appetitive and Consummatory Behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2014).
