Multi-Fiber fotometrie om neurale activiteit op te nemen in vrij bewegende dieren
Summary
Dit protocol Details over het implementeren en uitvoeren van multi-Fiber fotometrie opnames, hoe te corrigeren voor calcium-onafhankelijke artefacten, en belangrijke overwegingen voor Dual-Color photometrie beeldvorming.
Abstract
Het vastleggen van de activiteit van een groep neuronen in een vrij bewegend dier is een uitdagende onderneming. Bovendien, als de hersenen wordt ontleed in kleinere en kleinere functionele subgroepen, het wordt essentieel om op te nemen van projecties en/of genetisch gedefinieerde subpopulaties van neuronen. Fiber photometrie is een toegankelijke en krachtige aanpak die deze uitdagingen kan overwinnen. Door het combineren van optische en genetische methodologieën, neurale activiteit kan worden gemeten in diepe hersenstructuren door het uitdrukken van genetisch gecodeerde calcium indicatoren, die neurale activiteit vertalen in een optisch signaal dat gemakkelijk kan worden gemeten. Het huidige protocol Details van de onderdelen van een multi-Fiber photometrie systeem, hoe toegang tot diepe hersenstructuren te leveren en verzamelen van licht, een methode om rekening te maken voor bewegings artefacten, en hoe te verwerken en analyseren van fluorescerende signalen. Het protocol Details experimentele overwegingen bij het uitvoeren van single en Dual Color Imaging, van één of meerdere geïmplanteerde optische vezels.
Introduction
De mogelijkheid om te correleren van neurale reacties met specifieke aspecten van het gedrag van een dier is essentieel om te begrijpen van de rol die een bepaalde groep van neuronen speelt bij het regisseren of reageren op een actie of stimulus. Gezien de complexiteit van dierlijk gedrag, met de talloze interne toestanden en externe stimuli die zelfs de eenvoudigste acties kunnen beïnvloeden, kan het opnemen van een signaal met een enkele proef resolutie onderzoekers voorzien van de nodige instrumenten om deze te overwinnen Beperkingen.
Fiber photometrie is uitgegroeid tot de techniek van de keuze voor veel onderzoekers op het gebied van systemen neurowetenschappen vanwege de relatieve eenvoud in vergelijking met andere in vivo opnametechnieken, de hoge signaal-ruis verhouding, en de mogelijkheid om op te nemen in een verscheidenheid van gedrags paradigma’s1,2,3,4,5,6,7,8. In tegenstelling tot traditionele elektrofysiologische methoden, is photometrie de optische benadering die het vaakst wordt gebruikt in combinatie met genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs, de GCaMP-serie)9. GECIs veranderen hun vermogen om te fluoresceren op basis van of ze zijn gebonden aan calcium. Omdat de interne concentratie van calcium in neuronen zeer strak gereguleerd en voltage-gated calcium kanalen open wanneer een neuron een actiepotentiaal vuurt, voorbijgaande verhogingen van de interne calciumconcentratie, die resulteren in voorbijgaande verhogingen in de vermogen van een GECI tot fluorescentie, kan een goede proxy voor neuronale afvuren9.
Met Fiber photometrie, excitatie licht is gericht naar beneden een dunne, multimode glasvezel in de hersenen, en een emissie signaal wordt verzameld terug via dezelfde vezels. Omdat deze optische vezels lichtgewicht en buigzaam zijn, kan een dier grotendeels ongehinderd bewegen, waardoor deze techniek compatibel is met een breed scala aan gedrags tests en-voorwaarden. Sommige voorwaarden, zoals snelle bewegingen of buigen van het Fiber-Optic patch snoer buiten de straal waarop het totale inwendige reflectie kan behouden, kunnen signaal artefacten introduceren. Om een signaal van lawaai te maken, kunnen we een eigendom van GCaMP exploiteren dat bekend staat als het “isosbestic Point”. In het kort, met GCaMP, naarmate de golflengte van het excitatie lampje naar links verschuift, neemt de uitstoot in de calcium-gebonden toestand af en neemt de emissie in de calcium-afhankelijke toestand marginaal toe. Het punt waarop de relatieve intensiteit van deze twee emissies gelijk is, wordt het isosbestic-punt genoemd. Wanneer GCaMP op dit punt opgewonden is, wordt de emissie niet beïnvloed door veranderingen in interne calciumconcentraties en is de variantie in het signaal meestal te wijten aan verzwakking van het signaal van overbuiging van het Fiber-Optic patch snoer of de beweging van het zenuwweefsel ten opzichte van de geïmplanteerde vezels.
Elektrofysiologie van één eenheid is nog steeds de gouden standaard voor vrij bewegende in vivo opnames vanwege zijn eencellige en single-Spike niveau resolutie. Het kan echter moeilijk zijn om de moleculaire identiteit van de cellen die worden opgenomen te lokaliseren, en de post-hoc analyse kan behoorlijk moeizaam zijn. Hoewel Fiber photometrie geen eencellige resolutie heeft, staat het onderzoekers toe om vragen te stellen die onmogelijk zijn om te adresteren met traditionele technieken. Het combineren van virale strategieën met transgene dieren, de uitdrukking van GECIs kan worden gericht aan genetisch gedefinieerde neuronale typen te registreren populatie-of projectie gedefinieerde neurale activiteit, die kan worden uitgevoerd door het monitoren van calcium signaal direct bij axon terminals10,11. Bovendien, door het implanteren van meerdere Fiber-Optic cannulas, het is mogelijk om tegelijkertijd te bewaken neurale activiteit uit verschillende hersengebieden en trajecten in hetzelfde dier12,13.
In dit manuscript beschrijven we een techniek voor single en multi-Fiber fotometrie, hoe te corrigeren voor calcium-onafhankelijke artefacten, en gedetailleerd hoe om mono-en Dual-Color opnames uit te voeren. We geven ook voorbeelden van de soorten vragen die het mogelijk maakt om te vragen en hun toenemende complexiteit (Zie Figuur 1). De fiber fotometrie Setup voor multi-Fiber opnames gedetailleerd in dit protocol kan worden gebouwd met behulp van een lijst van materialen gevonden op https://sites.Google.com/View/multifp/hardware (Figuur 2).
Het is essentieel dat het systeem wordt uitgerust voor zowel 410 nm als 470 nm excitatie golflengten voor calcium-onafhankelijke en calcium afhankelijke fluorescentie emissie van GCaMP6 of de varianten daarvan. Voor op maat gebouwde opstellingen of als er geen software beschikbaar is om het systeem uit te voeren, kan het vrije, open source programma Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) worden gebruikt. Als alternatief kan Fiber photometrie worden uitgevoerd via MATLAB (bijv. https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 of andere programmeertaal14. De software en hardware van het systeem moet het mogelijk maken manipulatie van zowel de 410 nm en 470 nm LEDs en de camera, extractie van beelden (Figuur 2), en berekening van de gemiddelde fluorescentie intensiteit in de regio’s van belang (Rois) getekend rond de vezels op de afbeeldingen. De uitvoer moet een tabel zijn met gemiddelde intensiteitswaarden die zijn vastgelegd met de 470 nm-en 410 nm-Led’s van elke vezel in het patch snoer. Bij het uitvoeren van multi-Fiber experimenten, 400 μm gebundelde vezels kunnen het verkeer van muizen te beperken. In dergelijke gevallen raden we aan om 200 μm patch koorden te gebruiken, wat meer flexibiliteit biedt. Het kan ook mogelijk zijn om kleinere dummy kabels te gebruiken tijdens het trainen van muizen.
Het is van cruciaal belang om tijdpunten voor gebeurtenissen van belang te kunnen extraheren tijdens de overname van Fiber photometritry. Als het systeem niet direct voorziet in een ingebouwd systeem voor het integreren van Ttl’s voor specifieke gebeurtenissen, is het een alternatieve strategie om een tijdstempel toe te wijzen aan afzonderlijke tijdpunten die zijn vastgelegd om af te stemmen op specifieke tijden en gebeurtenissen tijdens het experiment. Tijdstempel kan worden gedaan met behulp van de computerklok.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fiber photometrie is een toegankelijke aanpak waarmee onderzoekers bulk-calcium dynamiek van gedefinieerde neuronale populaties in vrij bewegende dieren opnemen. Deze methode kan worden gecombineerd met een breed scala aan gedrags tests, waaronder ‘ zware bewegingstaken ‘ zoals geforceerde zwem tests2, angst-conditionering18, sociale interacties1,4en andere7, 8</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door een subsidie van de natuurwetenschappen en ingenieurs Onderzoekraad van Canada (NSERC: RGPIN-2017-06131) aan C.P. C. P. is een FRSQ chercheur-Boursier. We danken ook de Plateforme d’Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) voor de productie van de virale vectoren die in deze studie worden gebruikt.
Materials
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long | Thorlabs | SH25S100 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long | Thorlabs | SH25S050 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long | Thorlabs | SH25S038 | |
| 1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs | M59L01 | |
| 12.7 mm Optical Post | Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm Pedestal Post Holder | Thorlabs | PH20EM | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube | Thorlabs | KPS101 | |
| 20x objective | Thorlabs | RMS20X | #10 in Figure 2, #11 in Figure 5 |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs | CM1-DCH/M | #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5 |
| 405 nm LED | Doric Lenses | CLED_405 | #2 in Figure 2 |
| 410 nm bandpass filter | Thorlabs | FB410-10 | #5 in Figure 2; #7 in Figure 5 |
| 465 nm. LED | Doric Lenses | CLED_465 | #1 in Figure 2 |
| 470 nm bandpass filter | Thorlabs | FB470-10 | #4 in Figure 2; #6 in Figure 5 |
| 560 nm bandpass filter | Semrock | FF01-560/14-25 | #5 in Figure 5 |
| 560 nm LED | Doric Lenses | CLED_560 | #1 in Figure 3 |
| 5-axis kinematic Mount | Thorlabs | K5X1 | #11 in Figure 2, #12 in Figure 5 |
| Achromatic Doublet | Thorlabs | AC254-035-A-ML | #7 in Figure 2 |
| Adaptor for 405 collimator | Thorlabs | AD11F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Adaptor for ajustable collimator | Thorlabs | AD127-F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB1824 | |
| Clamping Fork | Thorlabs | CF125 | |
| Cube connector | Thorlabs | CM1-CC | |
| Dual 493/574 dichroic | Semrock | FF493/574-Di01-25×36 | #10 in Figure 5 |
| Emission filter for GCaMP6 | Semrock | FF01-535/22-25 | #6 in Figure 2 |
| Enclosure with Black Hardboard Panels | Thorlabs | XE25C9 | |
| Externally SM1-Threaded End Cap for Machining | Thorlabs | SM1CP2M | |
| Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder | Thorlabs | SM1QP | #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5 |
| Fixed Collimator for 405 nm light | Thorlabs | F671SMA-405 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Fixed collimator for 470 and 560 nm light | Thorlabs | F240SMA-532 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Green emission filter | Semrock | FF01-520/35-25 | In light beam splitter |
| High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera | Thorlabs | DCC3260M | #13 in Figure 2, #15 in Figure 5 |
| Light beam splitter | Neurophotometrics | SPLIT | #14 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff | Thorlabs | DMLP425R | #8 in Figure 2, #9 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff | Semrock | FF495-Di03 | #9 in Figure 2, #8 in Figure 5 |
| Metabond dental cement | C&B | ||
| M8 – M8 cable | Doric Lenses | Cable_M8-M8 | |
| Optic fiber cannulas | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Optic fiber Patchcords | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Red emission filter | Semrock | FF01-600/37-25 | In light beam splitter |
| T7 LabJack | LabJack | ||
| T-cube LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 | Thorlabs | CAB-DCU-T3 |
References
- Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
- Proulx, C. D., et al. A neural pathway controlling motivation to exert effort. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (22), 5792-5797 (2018).
- Muir, J., et al. In Vivo Fiber Photometry Reveals Signature of Future Stress Susceptibility in Nucleus Accumbens. Neuropsychopharmacology. 43 (2), 255-263 (2017).
- Wang, D., et al. Learning shapes the aversion and reward responses of lateral habenula neurons. eLife. 6, (2017).
- de Jong, J. W., et al. A Neural Circuit Mechanism for Encoding Aversive Stimuli in the Mesolimbic Dopamine System. Neuron. 101 (1), 133-151 (2018).
- Lerner, T. N., et al. Intact-Brain Analyses Reveal Distinct Information Carried by SNc Dopamine Subcircuits. Cell. 162 (3), 635-647 (2015).
- Calipari, E. S., et al. In vivo imaging identifies temporal signature of D1 and D2 medium spiny neurons in cocaine reward. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2726-2731 (2016).
- González, A. J., et al. Inhibitory Interplay between Orexin Neurons and Eating. Current Biology. 26 (18), 2486-2491 (2016).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
- Siciliano, C. A., Tye, K. M. Leveraging calcium imaging to illuminate circuit dysfunction in addiction. Alcohol. 74, 47-63 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
- Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
- Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Scientific Reports. 9 (1), 3521 (2019).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocol. 7 (1), 12-23 (2011).
- Stamatakis, A. M., et al. Lateral Hypothalamic Area Glutamatergic Neurons and Their Projections to the Lateral Habenula Regulate Feeding and Reward. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 302-311 (2016).
- Tervo, G. D., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Yu, K., da Silva, P., Albeanu, D. F., Li, B. Central Amygdala Somatostatin Neurons Gate Passive and Active Defensive Behaviors. The Journal of Neuroscience. 36 (24), 6488-6496 (2016).
- Falkner, A. L., Grosenick, L., Davidson, T. J., Deisseroth, K., Lin, D. Hypothalamic control of male aggression-seeking behavior. Nature Neuroscience. 19 (4), 596-604 (2016).
- Ren, J., et al. Anatomically Defined and Functionally Distinct Dorsal Raphe Serotonin Sub-systems. Cell. 175 (2), 472-487 (2018).
- Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLOS ONE. 12 (2), 0170934 (2017).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), (2018).
- Feng, J., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Detection of Norepinephrine. Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
- Wang, H., Jing, M., Li, Y. Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators. Current Opinion in Neurobiology. 50, 171-178 (2018).
- Lu, L., et al. Wireless optoelectronic photometers for monitoring neuronal dynamics in the deep brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1374-1383 (2018).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing Hypothalamic Network Dynamics for Appetitive and Consummatory Behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2014).
