単純ヘルペスウイルス1型にオートファジーを調節するsiRNAエレクトロポレーション 1-感染単球由来樹状細胞

単球由来DCは、健康なドナーの白血球化産物から生成された。このため、地方倫理委員会から肯定的な投票が得られた(参照番号4556)。本研究の実験は、「フリードリヒ・アレクサンダー・ユニバーシテット・エアランゲン=ニュルンベルク」の倫理委員会の勧告に従って行われた(参考番号4556)。すべての寄付者は、ヘルシンキ宣言に従って、書面によるインフォームド・コンセントを承認しました。 1. 未熟樹状細胞(iDC)及び成熟樹状細胞(mDC)の生成と取り扱い ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、前述の27のように白血縮系チャンバ(LRSC)から単離する。PBMCの凍結保存を避け、分離時に直接使用して、より高いDC収率を得ます。 前述の10、27に記載のT175細胞培養フラスコにおける異なる健康ドナーのPBMCからヒトDCを生成する。簡単に言えば、30mLのDC培地(L-グルタミンを含まないRPMI 1640、1%(v/v)AB-血清、100 U/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン、0.4 mM L-グルタミン、10mM HEPES)細胞を単細胞の浸着細胞1株当たりに使用する。1時間後、RPMI 1640を用いて非付着画分を洗い流す。800 U/mL GM-CSFおよび250 U/mL IL-4を補充した新鮮なDC培地を加え、3日間インキュベートする。 3日目のポスト付着で、GM-CSFとIL-4を含む新鮮なDC培地を5mL追加し、それぞれ400 U/mL、細胞培養フラスコあたり250 U/mLの最終濃度をDC分化にします。 iDCを収穫するには、細胞培養フラスコの底部から緩やかに接着したiDCを軽く洗い、4日目に付着した後にすすすします。この手順を 2 回繰り返します。mDCの生成には、GM-CSF(最終濃度:40 U/mL)、IL-4(最終濃度:250 U/mL)、IL-6(最終濃度:1000 U/mL)、IL-1β(最終濃度:200U/mL)、TNF-α(最終濃度:10ng/)で構成される成熟カクテルを追加します。mL)、プロスタグランジンE2(PGE2;最終濃度:1μg/mL)。 6日後の付着後(サイトカインカクテルを用いた成熟誘導の2日後)、細胞培養フラスコの底部からmDCをリンスする。この手順を 2 回繰り返します。注:未熟なDCと成熟したDCは、1細胞培養フラスコ内の同一のドナーから順次生成することができる。これを行うには、(i)iDCの適切な数を分離し、(ii)ステップ1.2.2に記載されたサイトカインカクテルを使用してフラスコ内の残りの細胞の成熟を誘導する。 それぞれの細胞培養培地のiDCまたはmDCを50mLチューブに移します。300 x gで5分間遠心分離を介して細胞を収穫します。 細胞培養フラスコあたり5~10 mLのRPMI 1640でDCを穏やかに再サスペンド(=洗浄)します。それぞれのDCサスペンションを1本のチューブに組み合わせます。 棚卸室または別の方法を使用してセル番号を定義します。iDC を取り扱う際の温度変化を避け、フェノールトの変化のリスクを軽減します。 2. フェノチピック成熟状態を監視するフローサイトメトリック解析 iDC または mDC (0.5 x 106)をステップ 1.3.1 から 1.5 mL チューブに転送します。3390 x gで遠心分離を介して細胞を1.5分間収穫し、FACS緩衝液(2%胎児子牛血清(FCS)を補充したPBS)で細胞を一度洗浄します。 定義された表面分子に対する特異的フルオロクロム標識抗体を含む抗体染色溶液(FACSバッファー)の100μLで細胞を再中断する。 以下の抗体を使用して、純度(CD3-FITC、CD14-PE)およびDC(CD80-PacBlue/-PE-Cy5、CD11c-PE-Cy5、CCR7-PE-Cy7、CD83-APC、CD86-PE、MHCII-APC-Cy7)の成熟状態を検証します。 コントロールとして100°LのFACSバッファに染色されていないサンプルを1つ用意します。 暗闇の中で細胞を氷の上に30分間染めます。 その後、FACS緩衝液1mLで細胞を2回洗浄し、3390 x gで1.5分間遠心分離機を洗浄する。 最後に、2%PFAを補完したFACS緩衝液の200μLで細胞を再サスペンドし、フローサイトメトリーにより細胞を分析します。固定細胞は、2日間まで暗闇の中で4°Cで保存することができます。 3. 単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)によるDCの感染手順と、スパウチン-1またはバフィロマイシン-A1を介したHSV-1誘導オートファジーフラックスの干渉 注:本研究で使用した株HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43(HSV-1 EGFP)は、実験室株HSV-1株17+から得られた。HSV-1 EGFP株は、CMVプロモーターの制御下でUL43遺伝子遺伝子座に挿入された増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)を発現する。EGFPはHSV-1感染のマーカーとして機能する。さらに、株HSV1-RFPVP26は、DC感染研究に使用された(前述のトゥーランら、2019年参照)。このウイルスは、カプシド表面タンパク質VP26をモノマー赤色蛍光タンパク質(mRFP)に融合して発現する。 iDC または mDC (2 x 106)をステップ 1.3 から 2 mL チューブに転送します。その後、3390 x gの細胞を1.5分間遠心分離し、上清を廃棄する。 感染培地(RPMI 1640 20 mM HEPESを添加)で細胞を穏やかに再中断します。 オートファゴソーム・リソソーム分解経路を阻害するには、感染前にスプーチン-1またはバフィロマイシン-A1 1時間でDCを前処理する。感染媒体に10μMスパウチン-1または1μM BA1、またはDMSOを未処理のコントロールとして追加します。300rpmで300rpmで1時間揺れる加熱ブロック内の細胞をインキュベートする。 感染研究では、2の感染の多重度(MOI)でHSV-1ビリオンで細胞を接種します。MNT緩衝液のそれぞれの体積(30mM 2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)、100 mM NaCl、20 mMトリス)をモックコントロールとして加えます。300rpmで300rpmで1時間揺れる加熱ブロック内の細胞をインキュベートする。 1時間後感染(hpi)、3390 x gで細胞を1.5分集め、GM-CSFの40 U/mL、IL-4の250 U/mL、および10μMスパウチン-1、1μM BA1、またはDMSOを含むDC培地中の細胞を穏やかに再サスペンドします。種子模擬処理およびHSV-1感染細胞を最終濃度1x 106/mLで6ウェルプレートに入れた。 16~24 hpiで、すすす(mDC)またはセルスクレーパー(iDC)を使用して細胞を収穫します。細胞を1.5 mLのセーフロックチューブに移します。 3390 x gで1.5分間遠心分離で細胞を採取し、1mLのPBSを加えてペレットを1回洗浄します。 2x Roti-Loadの29°L、1μL 100 mM MgCl2および12.5 U/mLベンゾマーゼを含むリシスミックス中の細胞を激しく再サスペンドします。 ベンゾラーゼを用いた細胞リシスおよびDNA消化の場合、サンプルを37°Cで10分間インキュベートします。その後、タンパク質を95°Cで10分間変性する。 SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析を実行して、LC3BI/II、p62、ICP0/5、およびGAPDHのタンパク質レベルを検証します。 4. FIP200-siRNAを用いたiDCのエレクトロポレーションによるHSV-1誘導オートファジーフラックスの干渉 注:siRNAエレクトロポレーションの本プロトコルは、Prechtelら(2007)およびGererら(2017)から改変された。 iDC (12 x 106) を 3.5 日目に 50 mL チューブに転送します。続いて、細胞を300 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。並行して、フローサイトメトリック分析を実行して、ステップ 2(CD80-PacBlue の代わりにライフ/デッドバイオレットを使用)の説明に従って成熟状態を監視します。 フェノールレッドなしでOptiMEMの5 mLでiDCを軽く洗浄し、細胞を300 x gで5分間遠心分離します。細胞を氷の上に置き、温度変化を避けてください。迅速に移動し、フェノールレッドなしでOptiMEMのiDCの長い潜伏期間を避けてください。 FIP200特異的siRNAの75pmolまたはスクランブルsiRNAの75 pmolのいずれかをコントロールとして、4mmの電気キュベットに移し、細胞懸濁液の100μL(6×106細胞)を加える。エレクトロポレーション装置Iを用いて直接パルスiDC、以下の設定を適用する:500V/1ms。 実験手順の前に、メーカーの指示に従ってsiRNA懸濁液を調製し、アリコートし、-20°Cで保存します。エレクトロポレーションにこれらのsiRNAを使用する場合は、解凍し、氷の上に保ちます。試料を電気分解する前に、テストパルスを行います。 エレクトロポレーション後、新鮮な事前温めDC培地(GM-CSFの40 U/mLとIL-4の250 U/mLを補足)でiDCを6ウェルプレートに直接移します。細胞を1 x 106/mLの最終濃度で播種し、インキュベーターに入れ子にします。エレクトロキュベットから細胞をすすり抜けないでください。 48時間後、まず電気ポレーションされたiDCの形態を顕微鏡で調べる。次いで、細胞スクラップを用いて細胞を収穫し、15mLチューブに移す。0.01TAを補充した1 mLのPBSで井戸をすすいで、それぞれのチューブに溶液を転写します。 続いて、次のステップで説明するように、siRNA条件ごとに6 x 10 6 iDCを分割する。 0.5 x 106細胞を使用して、ステップ2で説明したように成熟状態および細胞生存率を評価する。CD11c-PE-Cy5、CCR7-PE-Cy7、CD83-APC、MHCII-APC-Cy7、ライフ/デッドバイオレットの抗体を使用してください。 ウェスタンブロット解析には1 x 106セルを使用して、FIP200固有のノックダウン効率を検証します。3390 x gで1.5分間遠心分離して1.5 mLのセーフロックチューブに細胞を移し、収穫します。 HSV-1感染実験には残りの細胞(4.5 x 106)を使用してください。実験条件ごとに、2.25 x 106 iDC を 2 mL チューブに転送し、2 の MOI で HSV1 に感染させるか、MNT バッファをモック コントロールとして追加します。ステップ3.3の説明に従って感染を実行する。 20 hpiで、細胞スクレーパーを用いて細胞を採取し、ステップ3.4で説明したようにウェスタンブロット分析のために細胞溶解物を調製する。 5. KIF1B/2A-siRNAエレクトロポレーションを用いたHSV-1感染mDCにおけるオートファゴソーム-リソソーム経路の変調 4日目にiDC(24 x 106)を50 mLチューブにポスト付着して転送します。続いて、細胞を300 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。 PBSの8mLでiDCを穏やかに再サスペンド(=洗浄)し、3x 106/mLの最終細胞濃度を調整する。3 x 106細胞を1.5mLチューブに移し、3390 x gで1.5分間収穫します。 サプリメントミックスを含むバッファP3の100μLでiDCを再サスペンド(メーカーの指示に従い、エレクトロポレーションキット装置II)と(i)KIF1B特異的siRNAの75 pmol、(ii)KIF2A特異的siRNAの75 pmol、または(iii)両方。(iv)スクランブルsiRNAの各量を対照として用いる。siRNA条件ごとに2本のチューブ(6 x 106細胞)を準備し、懸濁液を別々のエレクトロキュベットに移します。エレクトロポレーション装置IIを用いてパルス「EH-100」を印加する直接パルスiDC。 実験手順の前に、メーカーの指示に従ってsiRNA懸濁液を調製し、アリコートし、-20°Cで保存します。エレクトロポレーションにこれらのsiRNAを使用する場合は、解凍し、氷の上に保ちます。氷の上にiDCを置き、温度変化を避けないでください。迅速に移動し、PBSまたはバッファP3内のiDCの長いインキュベーションを避けてください。 エレクトロポレーション直後に、500 μL の事前温め RPMI 1640 をエレクトロキュベットに追加します。インキュベーターで細胞を5~10分間インキュベートし、iDCを新鮮な事前温めDC培地(GM-CSFの40 U/mL、IL-4の250 U/mLを補充)で6ウェルプレートに移します。それぞれの条件を1つのウェルに結合し、1·106/mLの最終濃度で細胞を播種し、インキュベーターに入れ子にします。 インキュベーション後4時間、ステップ1.2.2に記載のサイトカインを含む成熟カクテルを加える。注:エレクトロポレーション後2日のフローサイトメトリック解析の制御として、非エレクトロポレーションドDC(1 x 106)から1つのサンプルを準備します。制御細胞を電気ポレーションされたサンプルと同様に扱います。 エレクトロポレーション後2日間、懸濁液により細胞を収穫し、15mLチューブに移す。1 mLのPBSで井戸をすすいで、それぞれのチューブに懸濁液を移します。以下のステップで説明するように、siRNA条件ごとに6·10 6 DCを分割します。 0.25 x 106 DC(電気ポレーションおよび非エレクトロポレーション)を使用して、ステップ 2 で説明したように成熟状態とセルの生存率を確認します。CD80-PE-Cy5、CD83-APC、CD86-PE、MHCII-APC-Cy7、ライフ/デッドバイオレットの抗体を使用してください。 ウェスタンブロット解析には0.75 x 106セルを使用して、KIF1B/2A特異的ノックダウン効率を評価します。3390 x gで1.5分間遠心分離して1.5 mLのセーフロックチューブに細胞を集め、ステップ3.4の説明に従って細胞溶解物を準備し、ウェスタンブロット分析を行います。 各siRNA状態から残りの細胞(5 x 106)を使用し、HSV-1感染実験を行います。実験条件ごとに、2.5 x 106 iDC を 2 mL チューブに転送し、2 の MOI で HSV-1 に感染させるか、MNT バッファをモック コントロールとして追加します。ステップ3.3の説明に従って感染を実行する。 20時間後の感染では、懸濁液によって細胞を採取し、ウェスタンブロット分析のために細胞溶解液を調製し、ステップ3.4で上述したようにHSV-1誘発オートファジー回転の誘導を検証する。