JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Kemik İliği Transplantasyon Platformu Greft-versus-Host Hastalığında Dendritik Hücrelerin Rolünü Araştırmak Için

Published: March 17, 2020
doi:
10.3791/60083
, , , , , , , ,
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences,University of Central Florida, 2Department of Biochemistry,Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences,Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology,University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences,University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center

Summary

Greft-versus-host hastalığı allojenik kemik iliği transplantasyonu sonrası önemli bir komplikasyondur. Dendritik hücreler greft-versus-host hastalığının patogenezinde kritik bir rol oynarlar. Bu makalede, dendritik hücrelerin greft-versus-host hastalığı nın gelişimindeki rolünü ve greft-versus-lösemi etkisinin araştırılması için yeni bir kemik iliği transplantasyon platformu açıklanmaktadır.

Abstract

Allojeneik kemik iliği transplantasyonu (KNOT), tümörlerin kökünü kurutmak için greft-versus-lösemi (GVL) etkisine bağlı hematolojik maligniteler için etkili bir tedavi yöntemidir. Ancak, uygulama greft-versus-host hastalığı gelişimi ile sınırlıdır (GVHD), BMT önemli bir komplikasyon. GVHD donör greftlerinde T-hücreleri alıcı hücreler tarafından ifade alloantijen tanımak ve alıcı sağlıklı dokulara karşı istenmeyen immünolojik saldırılar monte uyarılır. Böylece, geleneksel tedaviler donör T-hücre alloreactivity bastırmak için tasarlanmıştır. Ancak, bu yaklaşımlar gvl etkisini önemli ölçüde bozar, böylece alıcının hayatta kalması iyileştirilmez. Terapötik yaklaşımların BMT, GVL ve GVHD üzerindeki etkilerini anlamak bu nedenle önemlidir. Donör T-hücrelerini uyarmak için antijen sunum ve sitokin salgılayıcı kapasiteleri nedeniyle, alıcı dendritik hücreler (DCs) GVHD indüksiyonönemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, alıcı DC’leri hedefleme gvhd kontrol etmek için potansiyel bir yaklaşım haline gelir. Bu çalışma, ev sahibi DC’lerin transplantasyon sonrası GVH ve GVL yanıtlarını nasıl düzenlediğini araştırmak için yeni bir BMT platformunun açıklamasını sağlar. Ayrıca transplantasyon sonrası GVHD ve GVL biyolojisini incelemek için etkili bir BMT modeli sunulmaktadır.

Introduction

Allojeneik hematopoetik kök hücre nakli (KT) hematolojik malignitelerin tedavisinde etkili bir tedavidir1,2 greft-versus-lösemi (GVL) etkisi ile3. Ancak, donör lenfositler her zaman alıcı dokulara karşı istenmeyen immünolojik ataklar monte, greft-versus-host hastalığı olarak adlandırılan bir süreç (GVHD)4.

GVHD Murine modelleri GVHD ve GVLyanıtı5 biyolojisini incelemek için etkili bir araçtır. Fareler uygun maliyetli bir araştırma hayvan modelidir. Onlar küçük ve verimli moleküller ve biyolojik geliştirmeninerken aşamalarında ile dosed 6 . Onlar genetik olarak iyi tanımlanmış, çünkü fareler genetik manipülasyon çalışmaları için ideal araştırma hayvanlar, hangi biyolojik yollar ve mekanizmaları incelemek için idealdir6. C57BL/6 (H2b) ile BALB/c (H2d)ve FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,7gibi birkaç fare majör histouyumluluk kompleksi (MHC) MHC uyumsuzmodelleri iyi kurulmuştur. Bunlar, bireysel hücre tiplerinin, genlerin ve GVHD’yi etkileyen faktörlerin rolünü belirlemek için özellikle değerli modellerdir. C57/BL/6 (H2b)ebeveyn donörlerinden MHC I (B6.C-H2bm1)ve/veya MHC II (B6.C-H2bm12)mutasyonu olan alıcılara yapılan transplantasyon, hem MHC sınıf I’de hem de sınıf II’de bir uyumsuzluk olduğunu ortaya koymuştur. Bu hem CD4+ ve CD8+ T-hücreleri hastalık gelişimi için gerekli olduğunu göstermektedir7,8. GVHD aynı zamanda ‘pro-inflamatuar sitokin fırtınası’ olarak bilinen inflamatuar bir kaskad yer almaktadır9. Murine modellerinde en sık kullanılan klima yöntemi x-ray veya 137Cs ile toplam vücut ışınlaması (TBI) yöntemidir. Bu alıcının kemik iliği ablasyon yol açar, böylece donör kök hücre engraftment izin ve greft reddini önlemek. Bu donör hücrelere yanıt olarak alıcı T-hücrelerinin çoğalmasını sınırlayarak yapılır. Ayrıca, genetik eşitsizlikler de küçük MHC-uyumsuzluk10bağlıdır hastalık indüksiyon, önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, miyeloablatif ışınlama dozu farklı fare suşlarında değişir (örneğin, BALB/c→C57BL/6).

Donör T-hücrelerinin konak antijen sunan hücreler (AAP’ ler) tarafından aktivasyonu GVHD gelişimi için gereklidir. ADC’ler arasında, dendritik hücreler (DCs) en güçlü. Onlar kalıtsal onların üstün antijen alımı nedeniyle GVHD indükleme yeteneğine sahiptirler, T-hücre ko-uyarıcı moleküllerin ekspresyonu, ve patojenik subsets içine T-hücreleri polarize pro-inflamatuar sitokinler üretimi. Alıcı DCs transplantasyon sonrası T-hücre astar ve GVHD indüksiyon kolaylaştırmak için kritik11,12. Buna göre, DCs GVHD tedavisinde ilginç hedefler haline gelmiştir12.

TBI donör hücre engraftment geliştirmek için gereklidir. TBI etkisi nedeniyle alıcı CD’ler aktive edilir ve transplantasyondan sonra kısa bir süre hayattakalır12. Biyolüminesans veya floresan kullanımındaki büyük gelişmelere rağmen, GVHD’de alıcı DC’lerin rolünü incelemek için etkili bir model oluşturmak hala zordur.

Donör T-hücreleri GVL aktivitesi için itici güç olduğundan, t-hücre alloreactivity bastırmak için steroid gibi immünsupresif ilaçlar kullanarak tedavi stratejileri genellikle tümör nüks veyaenfeksiyonneden 13. Bu nedenle, alıcı DC’leri hedeflemek GVL etkisini korurken ve enfeksiyondan kaçınırken GVHD tedavisinde alternatif bir yaklaşım sağlayabilir.

Kısacası, mevcut çalışma, alıcı DC’lerde farklı sinyal türlerinin GVHD gelişimini ve BMT’den sonra GVL etkisini nasıl düzenlediğini anlamak için bir platform sağlamaktadır.

Protocol

Deneysel prosedürler, Central Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. 1. GVHD İndüksiyon NOT: Allojeneik kemik iliği (BM) hücre nakli (adım 1.2) ışınlama dan sonra 24 saat içinde yapılır. Aşağıda açıklanan tüm işlemler steril bir ortamda gerçekleştirilir. Bir doku kültürü başlık prosedürü gerçekleştirin ve filtrelenmiş reaktifler kullanın. 0. Gün: Alıcı fareleri hazırlay…

Representative Results

Majör MHC uyumsuz B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd)modeli transplantasyon sonrası GVHD gelişimine yakından karşılık gelmektedir (Şekil 2). Cooke ve ark.16 tarafından daha önce tespit edilen altı GVHD klinik bulgunun tümü WT-B6 T-hücreleri ile nakledilen alıcılarda meydana gelmekte, ancak gvhd-negatif grubunu temsil eden BM ile nakledilen alıcılarda (adım 1.5) yer almıyordu. Bu modelde GVHD gelişiminde i…

Discussion

Belirli bir kişiye uygun kök hücre kullanımı gelişmiş ve dirençli kanserlerin tedavisinde etkili bir yaklaşımdır18. Küçük molekül ilaç, ancak, uzun kişiselleştirilmiş kanser tedavisinin birincil odak kalmıştır. Öte yandan, hücresel tedavide donör ve konak arasındaki etkileşimlerin çok sayıda kararlı tedavi sonuçlarını etkileyebilir, BMT sonra GVHD gelişimi gibi1.

BmT’nin MHC’li büyük fare modelleri GVHD’nin biy…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma University of Central Florida College of Medicine start-up hibe (HN), Pittsburgh Üniversitesi Tıp Merkezi Hillman Kanser Merkezi start-up hibe (HL), Amerika Birleşik Devletleri NIH Grant #1P20CA210300-01 ve Vietnam Sağlık Bakanlığı Hibe #4694/QD-BYT (PTH için) tarafından desteklenir. Güney Carolina Tıp Üniversitesi’nden Dr. Xue-zhong Yu’ya çalışma için malzeme sağladığı için teşekkür ederiz.

Materials

0.5 M EDTA pH 8.0 100ML Fisher Scientific BP2482100 MACS buffer
10X PBS Fisher Scientific BP3994 MACS buffer
A20 B-cell lymphoma University of Central Florida In house GVL experiment
ACC1 fl/fl Jackson Lab 30954 GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4cre University of Central Florida GVL experiment
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485 T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220) Thermo Fisher Scientific 13-0452-85 T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITC Thermo Fisher Scientific 10452-85 Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700 Thermo Fisher Scientific 117319 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PE Thermo Fisher Scientific 12-0251-82 Flow staining
Anti-Mouse CD4 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-0041-86 T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) Thermo Fisher Scientific 48-0042-82 Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PE Thermo Fisher Scientific 12-0900-83 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APC Thermo Fisher Scientific 17-0081-83 Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-5958-82 Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APC Thermo Fisher Scientific 17-5320-82 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-5921-85 T-cell enrichment
Anti-Thy1.2 Bio Excel BE0066 BM generation
B6 fB-/- mice University of Central Florida In house Recipients
B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice Charles River 564 Donors
BALB/c mice Charles River 028 Transplant recipients
C57BL/6 mice Charles River 027 Donors/Recipients
CD11b Thermo Fisher Scientific 13-0112-85 T-cell enrichment
CD25-biotin Thermo Fisher Scientific 13-0251-82 T-cell enrichment
CD45R Thermo Fisher Scientific 13-0452-82 T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin Thermo Fisher Scientific 13-5971-82 T-cell enrichment
Cell strainer 40 uM Thermo Fisher Scientific 22363547 Cell preparation
Cell strainer 70 uM Thermo Fisher Scientific 22363548 Cell preparation
D-Luciferin Goldbio LUCK-1G Live animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Bilogicals R&D system D17051 Cell Culture
Flow cytometry tubes Fisher Scientific 352008 Flow cytometry analysis
FVB/NCrl Charles River 207 Donors
Lipopolysacharide (LPS) Millipore Sigma L4391-1MG DC mature
LS column Mitenyi Biotec 130-042-401 Cell preparation
MidiMACS Miltenyi Biotec 130-042-302 T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubator Eppendorf Galaxy 170 R Cell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140 Media
RPMI 1640 Thermo Fisher Scienctific 11875-093 Media
TER119 Thermo Fisher Scientific 13-5921-82 T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200 Perkin Elmer Xenogen IVIS-200 Live animal imaging
X-RAD 320 Biological Irradiator Precision X-RAY X-RAD 320 Total Body Irradiation
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
  2. Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
  3. Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
  4. Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
  5. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
  6. Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006 (2018).
  7. Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
  8. Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
  9. Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
  10. Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
  11. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  12. Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
  13. Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
  14. Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  15. Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
  16. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  17. Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
  18. McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417 (2013).
  19. Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
  20. Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
  21. Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
  22. Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
  23. Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
  24. Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).

Tags

Bone Marrow TransplantationDendritic CellsGraft-versus-host DiseaseT-cell DepletionCell IsolationCell CultureImmune Cell PopulationsMacrophagesNeutrophilsCell RegenerationBone Marrow PreparationCell HarvestingCell StrainingCell WashingCell ResuspensionCell IncubationCell CountingCell Pooling

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Nguyen, H. D., Huong, P. T., Hossack, K., Gurshaney, S., Ezhakunnel, K., Huynh, T., Alvarez, A. M., Le, N., Luu, H. N. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. (157), e60083, doi:10.3791/60083 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image