Summary

Plate-forme de transplantation de moelle osseuse pour étudier le rôle des cellules dendritiques dans la maladie de greffe-contre-hôte

Published: March 17, 2020
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Summary

La maladie de greffe-contre-hôte est une complication principale après la transplantation allogeneic de moelle. Les cellules dendritiques jouent un rôle critique dans la pathogénie de la maladie de greffe-contre-hôte. L’article actuel décrit une nouvelle plate-forme de transplantation de moelle osseuse pour étudier le rôle des cellules dendritiques dans le développement de la maladie de greffe-contre-hôte et de l’effet de greffe-contre-leucémie.

Abstract

La transplantation allogeneic de moelle (BMT) est une thérapie efficace pour des malignités hématologiques due à l’effet de greffe-contre-leucémie (GVL) pour éradiquer des tumeurs. Cependant, son application est limitée par le développement de la maladie de greffe-contre-hôte (GVHD), une complication majeure de BMT. GVHD est évoqué quand les lymphocytes T dans les greffes de donneur reconnaissentalloantigen exprimées par les cellules de destinataire et montent des attaques immunologiques indésirables contre les tissus sains de destinataire. Ainsi, les thérapies traditionnelles sont conçues pour supprimer l’alloreactivité de T-cellule de donneur. Cependant, ces approches nuisent considérablement à l’effet GVL afin que la survie du receveur ne soit pas améliorée. Il est donc essentiel de comprendre les effets des approches thérapeutiques sur le BMT, le GVL et le GVHD. En raison des capacités de présentation et de sécrétion de cytokine de l’antigène pour stimuler les lymphocytes T donneurs, les cellules dendritiques du receveur jouent un rôle significatif dans l’induction de GVHD. Par conséquent, le ciblage des CD destinataire devient une approche potentielle pour contrôler GVHD. Ce travail fournit une description d’une nouvelle plate-forme BMT pour étudier comment les DCs hôtes régulent les réponses GVH et GVL après la transplantation. Un modèle BMT efficace pour étudier la biologie de la GVHD et du GVL après la transplantation est également présenté.

Introduction

La transplantation de cellules souches hématopoïétiques allogéniques (BMT) est une thérapie efficace pour traiter les malignités hématologiques1,2 par l’effet greffe-contre-leucémie (GVL)3. Cependant, les lymphocytes de donneur montent toujours des attaques immunologiques non désirées contre des tissus de destinataire, un processus appelé greffe-contre-hôte maladie (GVHD)4.

Les modèles murins de GVHD sont un outil efficace pour étudier la biologie de GVHD et la réponse GVL5. Les souris sont un modèle animal de recherche rentable. Ils sont petits et efficacement dosés avec des molécules et des produits biologiques aux premières phases du développement6. Les souris sont des animaux de recherche idéaux pour les études de manipulation génétique parce qu’ils sont génétiquement bien définis, ce qui est idéal pour étudier les voies biologiques et les mécanismes6. Plusieurs modèles de souris majeure histocompatibilité complexe (MHC) MHC-dépareillé modèles de GVHD ont été bien établis, tels que C57BL/6 (H2b) à BALB / c (H2d) et FVB (H2q) C57BL/6 (H2b)5,7. Ce sont des modèles particulièrement précieux pour déterminer le rôle des types de cellules, des gènes et des facteurs qui affectent la GVHD. La transplantation de C57/BL/6 (H2b) donneurs parentaux à des receveurs présentant des mutations dans le MHC I (B6.C-H2bm1) et/ou MHC II (B6.C-H2bm12) a révélé qu’un décalage dans la classe I et la classe II du MHC est une exigence importante pour le développement de GVHD aigus. Ceci suggère que les cellulesT de CD4et de CD8 sont exigées pour le développement de la maladie7,,8. GVHD est également impliqué dans une cascade inflammatoire connue sous le nom de «tempête de cytokine pro-inflammatoire»9. La méthode de conditionnement la plus courante dans les modèles murins est l’irradiation totale du corps (TBI) par rayon X ou 137Cs. Ceci mène à l’ablation de moelle d’os du destinataire, permettant ainsi l’engraftment de cellules souches de donneur et empêchant le rejet de la greffe. Ceci est fait en limitant la prolifération des lymphocytes T bénéficiaires en réponse aux cellules de donneur. En outre, les disparités génétiques jouent un rôle important dans l’induction de la maladie, qui dépend également de l’inadéquation mineure du MHC10. Par conséquent, la dose d’irradiation myéloablative varie selon différentes souches de souris (p. ex., BALB/c-C57BL/6).

L’activation des lymphocytes T donneurs par les cellules présentant des antigènes hôtes (APC) est essentielle pour le développement de la DGV. Parmi les APC, les cellules dendritiques (DCs) sont les plus puissantes. Ils sont héréditairement capables d’induire le GVHD en raison de leur absorption supérieure d’antigène, expression des molécules co-stimulatrices de lymphocytes T, et production de cytokines pro-inflammatoires qui polarisent les lymphocytes T en sous-ensembles pathogènes. Les CD bénéficiaires sont essentiels pour faciliter l’amorçage des lymphocytes T et l’induction de GVHD après la transplantation11,12. En conséquence, les CDC sont devenus des cibles intéressantes dans le traitement de GVHD12.

TBI est nécessaire pour améliorer l’engraftment cellulaire donneur. En raison de l’effet TBI, les CD destinataires sont activés et survivent pendant une courte période après la transplantation12. Malgré les progrès importants dans l’utilisation de la bioluminescence ou de la fluorescence, l’établissement d’un modèle efficace pour étudier le rôle des CD bénéficiaires dans le GVHD est toujours difficile.

Parce que les lymphocytes T donneurs sont la force motrice de l’activité GVL, les stratégies de traitement utilisant des médicaments immunosuppresseurs tels que les stéroïdes pour supprimer l’alloreactivité à cellule T causent souvent une rechute de tumeur ou une infection13. Par conséquent, le ciblage des CD destinataires peut fournir une approche alternative pour traiter le GVHD tout en préservant l’effet GVL et en évitant l’infection.

En bref, la présente étude fournit une plate-forme pour comprendre comment différents types de signalisation dans les CD destinataires régule le développement de GVHD et l’effet GVL après BMT.

Protocol

Les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Floride centrale. 1. Induction GVHD REMARQUE : La transplantation de cellules de moelle osseuse allogeneic (BM) (étape 1.2) est effectuée dans les 24 h après l’irradiation. Toutes les procédures décrites ci-dessous sont effectuées dans un environnement stérile. Effectuez la procédure dans un capot de culture tissul…

Representative Results

Le modèle B6 majeur dépareillé MHC (H2kb)-BALB/C (H2kd)correspondait étroitement au développement du GVHD après la transplantation(figure 2). Les six signes cliniques de GVHD établis précédemment par Cooke et coll.16 se sont produits dans les destinataires transplantés avec des lymphocytes T WT-B6 mais pas dans les destinataires transplantés avec BM seul (étape 1.5), qui représentaient le groupe GVHD-…

Discussion

L’utilisation de cellules souches pour convenir à une personne particulière est une approche efficace pour traiter les cancers avancés et résistants18. Les produits pharmaceutiques à petites molécules, cependant, sont longtemps restés un foyer principal de la thérapie personnalisée de cancer. D’autre part, dans la thérapie cellulaire une multitude d’interactions entre le donneur et l’hôte peut influencer de façon décisive les résultats du traitement, tels que le développemen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude est soutenue par l’Université de Central Florida College of Medicine subvention de démarrage (à HN), l’Université de Pittsburgh Medical Center Hillman Cancer Center start-up subvention (à HL), les États-Unis NIH Grant #1P20CA210300-01 et le ministère vietnamien de la Santé Grant #4694/QD-BYT (à PTH). Nous remercions le Dr Xue-zhong Yu de l’Université médicale de Caroline du Sud d’avoir fourni du matériel pour l’étude.

Materials

0.5 M EDTA pH 8.0 100ML Fisher Scientific BP2482100 MACS buffer
10X PBS Fisher Scientific BP3994 MACS buffer
A20 B-cell lymphoma University of Central Florida In house GVL experiment
ACC1 fl/fl Jackson Lab 30954 GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4cre University of Central Florida GVL experiment
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485 T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220) Thermo Fisher Scientific 13-0452-85 T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITC Thermo Fisher Scientific 10452-85 Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700 Thermo Fisher Scientific 117319 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PE Thermo Fisher Scientific 12-0251-82 Flow staining
Anti-Mouse CD4 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-0041-86 T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) Thermo Fisher Scientific 48-0042-82 Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PE Thermo Fisher Scientific 12-0900-83 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APC Thermo Fisher Scientific 17-0081-83 Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-5958-82 Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APC Thermo Fisher Scientific 17-5320-82 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-5921-85 T-cell enrichment
Anti-Thy1.2 Bio Excel BE0066 BM generation
B6 fB-/- mice University of Central Florida In house Recipients
B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice Charles River 564 Donors
BALB/c mice Charles River 028 Transplant recipients
C57BL/6 mice Charles River 027 Donors/Recipients
CD11b Thermo Fisher Scientific 13-0112-85 T-cell enrichment
CD25-biotin Thermo Fisher Scientific 13-0251-82 T-cell enrichment
CD45R Thermo Fisher Scientific 13-0452-82 T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin Thermo Fisher Scientific 13-5971-82 T-cell enrichment
Cell strainer 40 uM Thermo Fisher Scientific 22363547 Cell preparation
Cell strainer 70 uM Thermo Fisher Scientific 22363548 Cell preparation
D-Luciferin Goldbio LUCK-1G Live animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Bilogicals R&D system D17051 Cell Culture
Flow cytometry tubes Fisher Scientific 352008 Flow cytometry analysis
FVB/NCrl Charles River 207 Donors
Lipopolysacharide (LPS) Millipore Sigma L4391-1MG DC mature
LS column Mitenyi Biotec 130-042-401 Cell preparation
MidiMACS Miltenyi Biotec 130-042-302 T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubator Eppendorf Galaxy 170 R Cell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140 Media
RPMI 1640 Thermo Fisher Scienctific 11875-093 Media
TER119 Thermo Fisher Scientific 13-5921-82 T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200 Perkin Elmer Xenogen IVIS-200 Live animal imaging
X-RAD 320 Biological Irradiator Precision X-RAY X-RAD 320 Total Body Irradiation

References

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Cite This Article
Nguyen, H. D., Huong, P. T., Hossack, K., Gurshaney, S., Ezhakunnel, K., Huynh, T., Alvarez, A. M., Le, N., Luu, H. N. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. (157), e60083, doi:10.3791/60083 (2020).

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