Summary

עצם השתלת מח פלטפורמת לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים במחלה שתל-מול מארח

Published: March 17, 2020
doi:

Summary

שתל-מול-מארח מחלה הוא סיבוך גדול לאחר השתלת מח עצם allogeneic. תאים דנדריטים לשחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של השתל-מול-מארח המחלה. המאמר הנוכחי מתאר פלטפורמת השתלת מח עצם רומן כדי לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים בפיתוח של מחלת השתל מול מארח את השתל-נגד לוקמיה אפקט.

Abstract

השתלת מח עצם אלוגנאית (BMT) הוא טיפול יעיל עבור ממאירות המטולוגית בשל השפעת השתל נגד לוקמיה (GVL) האפקט לבער גידולים. עם זאת, היישום שלו מוגבל על ידי פיתוח של השתל-מול-מארחים מחלה (GVHD), סיבוך גדול של BMT. GVHD היא עוררה כאשר T-תאים ב שתלי התורם העצמית המתבטאת באמצעות התאים הנמען ולטעון התקפות אימונולוגיים לא רצויים נגד רקמות בריאות הנמען. לפיכך, טיפולים מסורתיים נועדו לדכא את כל פעילות ה-T-cell של התורם. עם זאת, גישות אלה פוגעות באופן משמעותי באפקט GVL כך שהישרדותו של הנמען אינה משופרת. הבנת ההשפעות של גישות טיפוליות על BMT, GVL, ו-GVL, כך חיוני. בגלל האנטיגן-הצגת ו cy, הפרשה יכולות לעורר את התורמים T-תאים, תאים דנדריטים הנמען (DCs) לשחק תפקיד משמעותי אינדוקציה של GVHD. משום כך, מיקוד בקרי תחום של נמענים הופך לגישה פוטנציאלית לשליטה ב-GVHD. עבודה זו מספקת תיאור של פלטפורמת BMT הרומן לחקור כיצד DCs מארחים להסדיר את התגובות גבול ו GVL לאחר ההשתלה. הציג גם מודל BMT יעיל ללמוד את הביולוגיה של GVHD ו GVHD לאחר ההשתלה.

Introduction

שיטת השתלת תא גזע המטמית (bmt) היא טיפול יעיל לטיפול בממאירות המטולוגית1,2 דרך השתל-נגד לוקמיה (gvl) אפקט3. עם זאת, לימפוציטים התורם תמיד לטעון התקפות אימונולוגיים לא רצויים נגד רקמות הנמען, תהליך הנקרא השתל-מול-מארחים מחלה (GVHD)4.

מודלים murine של GVHD הם כלי יעיל כדי ללמוד את הביולוגיה של GVHD ואת תגובת GVHD5. עכברים הם מודל חסכוני בחיות מחקר. הם קטנים וביעילות עם מולקולות ומוצרים ביולוגיים בשלבים מוקדמים של פיתוח6. עכברים הם חיות מחקר אידיאלי למחקרים גנטיים מניפולציה כי הם מוגדרים היטב גנטית, אשר אידיאלי עבור לימוד מסלולים ביולוגיים ומנגנונים6. מספר העכבר הגדול ביותר מורכב היסטולתאימות (mhc) mhc-מודלים לא תואמים של gvhd הוקמה היטב, כגון C57BL/6 (h2ב) כדי balb/c (h2d) ו fvb (h2q) → C57BL/6 (h2ב)5,7. אלה הם דגמים יקרי ערך במיוחד כדי לקבוע את התפקיד של סוגי תאים בודדים, גנים, וגורמים המשפיעים על GVHD. השתלת מ C57/BL/6 (H2ב) תורמים הורים לנמענים עם מוטציות ב mhc I (B6. c-H2bm1) ו/או Mhc II (B6. c-H2bm12) חשף כי אי התאמה הן בכיתה mhc i ו-class ii היא דרישה חשובה להתפתחות של gvhd חריפה. זה מרמז כי הן CD4+ ו CD8+ T-תאים נדרשים להתפתחות המחלה7,8. Gvhd הוא גם מעורב במפל דלקתי המכונה “הפרו-דלקת ציטוקינים” סערה9. שיטת המיזוג הנפוצה ביותר במודלים murine היא הקרנה מוחלטת של הגוף (TBI) על ידי X-ray או 137Cs. הדבר מוביל לאבלציה של המטופל, ובכך מאפשר לתאי גזע של תורם להתחשבן ולמנוע דחייה של השתל. פעולה זו מתבצעת על-ידי הגבלת ההתפשטות של תאי T של הנמען בתגובה לתאי תורם. בנוסף, הפערים הגנטיים ממלאים תפקיד חשוב באינדוקציה למחלות, שתלויה גם באי-התאמה משנית של MHC10. לכן, מינון myeloablative הקרנה משתנה בזנים שונים של העכבר (g., BALB/c → C57BL/6).

הפעלת תאים T-בתאי התורם על ידי מארח אנטיגן הצגת תאים (APCs) חיוני עבור פיתוח GVHD. בין ה-APCs, התאים הדנדריטים (DCs) הם החזקים ביותר. הם בעלי יכולת לספק GVHD בשל ספיגת אנטיגן מעולה שלהם, ביטוי של T-cell שיתוף מולקולות, והפקה של ציטוקינים pro-דלקתיים המיקטט T-תאים לתוך מערכות המשנה הפתוגניים. בקרי תחום של נמענים הם קריטיים להקלה על הטרמה של תא T והשראה לאחר השתלת11,12. בהתאם לכך, DCs הפכו למטרות מעניינות בטיפול ב-GVHD12.

נדרש TBI כדי להגביר את התיאום של תא התורם. עקב האפקט TBI, Dc DCs מופעלים ולשרוד זמן קצר לאחר ההשתלה12. למרות הפיתוחים העיקריים בשימוש בביולומינציה או בזריחה, הקמת מודל אפקטיבי לחקר התפקיד של בקרי התחום של הנמענים ב-GVHD עדיין מאתגרת.

מכיוון T-cell התורם הם כוח המניע של פעילות GVL, אסטרטגיות טיפול באמצעות תרופות מדכאים חיסוני כגון סטרואידים כדי לדכא את הפעילות alloreactivity לעתים קרובות לגרום להישנות הגידול או זיהום13. לכן, בקרי תחום של נמענים עלולים לספק גישה חלופית לטיפול ב-GVHD תוך שמירה על האפקט של GVHD והימנעות מהידבקות.

בקצרה, המחקר הנוכחי מספק פלטפורמה כדי להבין כיצד סוגים שונים של איתות בקרי Dc של נמענים מסדיר פיתוח GVHD והאפקט GVHD לאחר BMT.

Protocol

ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש באוניברסיטת מרכז פלורידה. 1. האינדוקציה GVHD הערה: מח עצם Allogeneic (BM) השתלת תא (שלב 1.2) מבוצעת בתוך 24 שעות לאחר ההקרנה. כל ההליכים המתוארים להלן מתבצעים בסביבה סטרילית. לבצע את ההליך במכסה התרבו…

Representative Results

ה-MHC הגדול-לא תואם B6 (H2kb)-balb/C (H2kd) מודל התכתב היטב לפיתוח gvhd לאחר ההשתלה (איור 2). כל ששת הסימנים הקליניים GVHD שנקבעו בעבר על ידי קוק ואח ’16 אירע הנמענים המושתלים עם WT-B6 T-תאים, אבל לא הנמענים מושתלים עם BM לבד (שלב 1.5), אשר ייצגו את הקבוצה gvhd-?…

Discussion

השימוש בתאי גזע להתאים אדם מסוים היא גישה יעילה לטיפול בסרטן מתקדם ועמיד18. תרופות מולקולה קטנה, עם זאת, נותרו זמן רב המוקד העיקרי של טיפול בסרטן אישית. מצד שני, בטיפול הסלולר המון אינטראקציות בין התורמים והמארחים יכולים להשפיע באופן מוחלט על תוצאות הטיפול, כגון פיתוח של GVHD לאח?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת מרכז פלורידה המכללה לרפואה סטארט-up מענק (כדי HN), אוניברסיטת פיטסבורג מרכז רפואי הילמן מרכז הסרטן להתחיל מענק (כדי HL), ארצות הברית NIH מענק #1P20CA210300-01 ו-ויאטנמית משרד מענק בריאות #4694/QD-BYT (כדי PTH). אנו מודים ד ר Xue-zhong יו באוניברסיטת הרפואית של דרום קרוליינה עבור מתן חומרים למחקר.

Materials

0.5 M EDTA pH 8.0 100ML Fisher Scientific BP2482100 MACS buffer
10X PBS Fisher Scientific BP3994 MACS buffer
A20 B-cell lymphoma University of Central Florida In house GVL experiment
ACC1 fl/fl Jackson Lab 30954 GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4cre University of Central Florida GVL experiment
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485 T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220) Thermo Fisher Scientific 13-0452-85 T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITC Thermo Fisher Scientific 10452-85 Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700 Thermo Fisher Scientific 117319 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PE Thermo Fisher Scientific 12-0251-82 Flow staining
Anti-Mouse CD4 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-0041-86 T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) Thermo Fisher Scientific 48-0042-82 Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PE Thermo Fisher Scientific 12-0900-83 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APC Thermo Fisher Scientific 17-0081-83 Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-5958-82 Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APC Thermo Fisher Scientific 17-5320-82 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-5921-85 T-cell enrichment
Anti-Thy1.2 Bio Excel BE0066 BM generation
B6 fB-/- mice University of Central Florida In house Recipients
B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice Charles River 564 Donors
BALB/c mice Charles River 028 Transplant recipients
C57BL/6 mice Charles River 027 Donors/Recipients
CD11b Thermo Fisher Scientific 13-0112-85 T-cell enrichment
CD25-biotin Thermo Fisher Scientific 13-0251-82 T-cell enrichment
CD45R Thermo Fisher Scientific 13-0452-82 T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin Thermo Fisher Scientific 13-5971-82 T-cell enrichment
Cell strainer 40 uM Thermo Fisher Scientific 22363547 Cell preparation
Cell strainer 70 uM Thermo Fisher Scientific 22363548 Cell preparation
D-Luciferin Goldbio LUCK-1G Live animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Bilogicals R&D system D17051 Cell Culture
Flow cytometry tubes Fisher Scientific 352008 Flow cytometry analysis
FVB/NCrl Charles River 207 Donors
Lipopolysacharide (LPS) Millipore Sigma L4391-1MG DC mature
LS column Mitenyi Biotec 130-042-401 Cell preparation
MidiMACS Miltenyi Biotec 130-042-302 T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubator Eppendorf Galaxy 170 R Cell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140 Media
RPMI 1640 Thermo Fisher Scienctific 11875-093 Media
TER119 Thermo Fisher Scientific 13-5921-82 T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200 Perkin Elmer Xenogen IVIS-200 Live animal imaging
X-RAD 320 Biological Irradiator Precision X-RAY X-RAD 320 Total Body Irradiation

References

  1. Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
  2. Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
  3. Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
  4. Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
  5. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
  6. Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006 (2018).
  7. Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
  8. Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
  9. Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
  10. Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
  11. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  12. Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
  13. Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
  14. Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  15. Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
  16. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  17. Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
  18. McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417 (2013).
  19. Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
  20. Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
  21. Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
  22. Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
  23. Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
  24. Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).

Play Video

Cite This Article
Nguyen, H. D., Huong, P. T., Hossack, K., Gurshaney, S., Ezhakunnel, K., Huynh, T., Alvarez, A. M., Le, N., Luu, H. N. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. (157), e60083, doi:10.3791/60083 (2020).

View Video