Um método para estudar a formação de novo dos domínios da cromatina
Summary
Este método é projetado para seguir a formação de domínios de cromatina mediada por PRC2 em linhas celulares, e o método pode ser adaptado para muitos outros sistemas.
Abstract
A organização e a estrutura dos domínios da cromatina são exclusivas para linhagens de células individuais. Sua desregulação pode levar a uma perda na identidade celular e/ou doença. Apesar dos esforços enormes, nosso entendimento da formação e propagação dos domínios da cromatina ainda é limitado. Os domínios da cromatina foram estudados em condições de estado estacionário, o que não é propício para seguir os acontecimentos iniciais durante o seu estabelecimento. Aqui, apresentamos um método para reconstruir os domínios da cromatina inducivelmente e seguir sua re-formação em função do tempo. Embora, aplicado primeiramente ao exemplo da formação repressivas PRC2-negociada do domínio da cromatina, poderia facilmente ser adaptado a outros domínios do cromatina. A modificação e/ou a combinação deste método com a genômica e as tecnologias de imagem fornecerá ferramentas inestimáveis para estudar o estabelecimento de domínios de cromatina em grande detalhe. Acreditamos que esse método irá revolucionar nossa compreensão de como os domínios da cromatina se formam e interagem uns com os outros.
Introduction
Os genomas eucarióticos são altamente organizados e as mudanças na acessibilidade da cromatina controla diretamente a transcrição do gene1. O genoma contém tipos distintos de domínios de cromatina, que se correlacionam com a atividade transcricional e o tempo de replicação2,3. Estes domínios da cromatina variam no tamanho de alguns kilobases (KB) a mais de 100 KB e são caracterizados por um enriquecimento em modificações distintas do histona4. As questões centrais são: como esses domínios são formados e como eles são propagados?
Um dos domínios mais bem caracterizados da cromatina é promovido através da atividade do complexo repressivo Polycomb 2 (PRC2). PRC2 é um complexo de múltiplas subunidades composto por um subconjunto do grupo polycomb (PcG) de proteínas5,6, ecatalisa a mono-, di-e trimetilação de lisina 27 de histona H3 (H3K27me1/ME2/ME3)7,8, 9,10. H3K27me2/ME3 estão associados a um Estado repressivo da cromatina, mas a função de H3K27me1 é obscura6,11. Um dos componentes centrais do PRC2, o desenvolvimento embrionário do ectoderma (EED), liga-se ao produto final da catálise PRC2, H3K27me3, através de sua gaiola aromática e esta característica resulta na estimulação alosterica de PRC212,13. A atividade enzimática PRC2 é crucial para preservar a identidade celular durante o desenvolvimento como a expressão inadequada de certos genes de desenvolvimento que são contraindicados para uma linhagem específica, seria prejudicial5,6 . Assim, desvendar os mecanismos pelos quais o PRC2 promove a formação de domínios de cromatina repressiva em mamíferos é de fundamental importância para a compreensão da identidade celular.
Todos os sistemas experimentais passados projetados investigar a formação do domínio da cromatina que inclui domínios PRC2-negociados da cromatina, foram executados condições de estado estacionário, que são incapazes de seguir os eventos de desdobramento da formação do domínio da cromatina em Células. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para gerar um sistema celular induzível que monitora o recrutamento inicial e a propagação de domínios de cromatina. Especificamente, nós nos concentramos em rastrear a formação de domínios de cromatina repressiva mediada por PRC2 que compõem H3K27me2/3. Esse sistema que pode captar os detalhes mecanísticos da formação do domínio da cromatina, pode ser adaptado para incorporar outros domínios da cromatina, como os domínios amplamente estudados, compreendendo H2AK119ub ou H3K9me. Em combinação com a genômica e as tecnologias de imagem, essa abordagem tem o potencial de abordar com sucesso várias questões-chave na biologia da cromatina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma abordagem poderosa para entender os detalhes mecanísticos durante a formação de um determinado domínio da cromatina, é primeiro interromper o domínio e, em seguida, rastrear sua reconstrução em andamento dentro das células. O processo pode ser pausado a qualquer momento durante a reconstrução para analisar detalhadamente os eventos em andamento. Estudos prévios sobre os domínios da cromatina não conseguiram resolver tais eventos, pois foram realizados em condições de estado estacionário (por exemplo,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos Drs. L. vales, D. Ozata e H. mou a revisão do manuscrito. O laboratório de D.R. é apoiado pelo Instituto médico de Howard Hughes e pelos institutos nacionais da saúde (R01CA199652 e R01NS100897).
Materials
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10×10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) – 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
References
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