Un metodo per studiare la formazione de novo dei domini della cromatina
Summary
Questo metodo è progettato per seguire la formazione di domini di cromatina mediati da PRC2 nelle linee cellulari e il metodo può essere adattato a molti altri sistemi.
Abstract
L’organizzazione e la struttura dei domini della cromatina sono uniche per le singole linee cellulari. La loro cattiva regolamentazione potrebbe portare a una perdita di identità cellulare e/o malattia. Nonostante gli enormi sforzi, la nostra comprensione della formazione e della propagazione dei domini della cromatina è ancora limitata. I domini di cromatina sono stati studiati in condizioni stabili, che non sono favorevoli a seguire gli eventi iniziali durante la loro istituzione. Qui, presentiamo un metodo per ricostruire indebitamente i domini della cromatina e seguire la loro ri-formazione in funzione del tempo. Anche se, prima applicato al caso di formazione del dominio cromatina repressiva mediata da PRC2, potrebbe essere facilmente adattata ad altri domini di cromatina. La modifica di e/o la combinazione di questo metodo con la genomica e le tecnologie di imaging fornirà strumenti preziosi per studiare in dettaglio la creazione di domini di cromatina. Crediamo che questo metodo rivoluzionerà la nostra comprensione di come i domini della cromatina si formano e interagiscono tra loro.
Introduction
I genomi eucarioti sono altamente organizzati e i cambiamenti nell’accessibilità della cromatina controllano direttamente la trascrizione genica1. Il genoma contiene diversi tipi di domini di cromatina, che sono correlati all’attività trascrizionale e alla temporizzazione della replicazione2,3. Questi domini di cromatina variano in dimensioni da pochi kilobase (kb) a più di 100 kb e sono caratterizzati da un arricchimento in distinte modifiche istoni4. Le domande centrali sono: come si formano questi domini e come vengono propagati?
Uno dei domini di cromatina più caratterizzati è favorito attraverso l’attività del complesso repressivo Polycomb 2 (PRC2). PRC2 è un complesso multi-sottounità composto da un sottoinsieme del Polycomb Group (PcG) delle proteine5,6, e catalizza la mono-, di- e trimetilazione di lisina 27 di istone H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 sono associati a uno stato di cromatina repressiva, ma la funzione di H3K27me1 non è chiara6,11. Uno dei componenti fondamentali della PRC2, sviluppo ectodernico embrionale (EED), si lega al prodotto finale della catalisi PRC2, H3K27me3, attraverso la sua gabbia aromatica e questa caratteristica si traduce nella stimolazione allosteric della PRC212,13. L’attività enzimatica PRC2 è cruciale per preservare l’identità cellulare durante lo sviluppo in quanto l’espressione inappropriata di alcuni geni dello sviluppo che sono controindicati per un lignaggio specifico, sarebbe dannosa5,6 . Pertanto, svelare i meccanismi attraverso i quali la RPC2 favorisce la formazione di domini di cromatina repressiva nei mammiferi è di fondamentale importanza per comprendere l’identità cellulare.
Tutti i sistemi sperimentali passati progettati per studiare la formazione di domini di cromatina, compresi i domini di cromatina mediati dalla RPC, sono stati eseguiti in condizioni stabili, che non sono in grado di monitorare gli eventi di svolgimento della formazione del dominio della cromatina Cellule. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per generare un sistema cellulare inducibile che monitora il reclutamento iniziale e la propagazione dei domini di cromatina. In particolare, ci concentriamo sul monitoraggio della formazione di domini di cromatina repressiva mediati da PRC2 che comprendono H3K27me2/3. Questo sistema in grado di cogliere i dettagli meccanicistici della formazione del dominio della cromatina, potrebbe essere adattato per incorporare altri domini della cromatina, come i domini ampiamente studiati che comprendono H2AK119ub o H3K9me. In combinazione con la genomica e le tecnologie di imaging, questo approccio ha il potenziale per affrontare con successo varie domande chiave nella biologia della cromatina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un approccio potente per comprendere i dettagli meccanicistici durante la formazione di un dato dominio cromatico, è quello di interrompere prima il dominio e poi monitorare la sua ricostruzione in corso all’interno delle cellule. Il processo può essere sospeso in qualsiasi momento durante la ricostruzione per analizzare in dettaglio gli eventi in corso. Studi precedenti sui domini di cromatina non sono stati in grado di risolvere tali eventi in quanto sono stati eseguiti in condizioni di stato costante (ad esempio, co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i dottori L. Vales, D. Ozata e H. Mou per la revisione del manoscritto. Il D.R. Lab è supportato dall’Howard Hughes Medical Institute e dal National Institutes of Health (R01CA199652 e R01NS100897).
Materials
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10×10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) – 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
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