שיטה ללמוד דה נובו היווצרות של כרומטין דומיינים
Summary
שיטה זו נועדה לעקוב אחר היווצרות תחומים PRC2-בתיווך כרומטין בקווי התא, ואת השיטה ניתן להתאים מערכות רבות אחרות.
Abstract
הארגון והמבנה של תחומי כרומטין הם ייחודיים לתאי תאים נפרדים. הטעות שלהם עלולה לגרום לאובדן זהות תאית ו/או מחלה. למרות מאמצים עצומים, ההבנה שלנו על היווצרות והתפשטות של תחומים כרומטין עדיין מוגבלת. תחומים כרומטין נחקרו בתנאים יציבים, אשר אינם מסייעות לעקוב אחר האירועים הראשוניים במהלך הקמתה. כאן, אנו מציגים שיטה ליצור מחדש תחומים כרומטין לשחזר ולעקוב אחר היווצרות שלהם כפונקציה של זמן. למרות, לראשונה מיושם על המקרה של PRC2-תיווך כרומטין היווצרות התחום, זה יכול להיות מותאם בקלות לתחומים אחרים כרומטין. שינוי ו/או שילוב של שיטה זו עם טכנולוגיות גנומיקה והדמיה יספק כלים יקרי ערך ללמוד את הקמתה של תחומים כרומטין בפירוט רב. אנו מאמינים ששיטה זו מהפכה את ההבנה שלנו לגבי אופן הפעולה של תחומים כרומטין ואינטראקציה זה עם זה.
Introduction
הגנום eukaryotic הם מאורגנים מאוד ושינויים בנגישות כרומטין ישירות שולטת בתמלול גנים1. הגנום מכיל סוגים שונים של תחומים כרומטין, אשר מתאם עם הפעילות הטרנססקריפט ושכפול עיתוי2,3. תחומים אלה כרומותין טווח בגודל של קילוסים מספר (kb) ליותר מ 100 kb והם מאופיינים על ידי העשרה שינויים ברורים ההיסטון4. השאלות המרכזיות הן: כיצד נוצרים תחומים אלה וכיצד הם מופצים?
אחד מתחומי כרומטין המאופיינת ביותר הוא מאומץ באמצעות הפעילות של קומפלקס הדיכוי הרב פוליקומב 2 (PRC2). PRC2 הוא קומפלקס רב ממדי subunit המורכב מקבוצת משנה של קבוצת פולימסרק (pcg) של חלבונים5,6, ו לזרז את מונו-, di-ו טריתילציה של ליזין 27 של היסטון H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 משויכים למצב כרומטין דכאני, אך תפקידה של H3K27me1 אינו ברור6,11. אחד המרכיבים המרכזיים של PRC2, פיתוח אאקטודרם עובריים (שלוש), נקשר למוצר הסופי של PRC2 זרז, H3K27me3, דרך הכלוב הארומטי שלה ותכונה זו מביא לגירוי אלוסטריה של PRC212,13. הפעילות הPRC2 אנזימטית חיונית לשימור הזהות התאית במהלך הפיתוח כביטוי בלתי הולם של גנים מסוימים התפתחותיים, כי הם התווית עבור שושלת מסוימת, יהיה מזיק5,6 . לפיכך, להתיר את המנגנונים שבהם PRC2 מטפחת היווצרות של תחומים כרומטין דכאניים ביונקים היא בעלת חשיבות יסודית להבנת הזהות התאית.
כל המערכות הנסיוניות האחרונות שתוכננו לחקור היווצרות דומיין כרומטין כולל תחומים PRC2-תיווך כרומטין, בוצעו בתנאים יציבים, אשר אינם יכולים לעקוב אחר אירועי התפתחות של היווצרות תחום של כרומטין ב תאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ליצור מערכת סלולרית inducible העוקבת אחר גיוס והפצה ראשונית של תחומים כרומטין. באופן ספציפי, אנו מתמקדים מעקב אחר היווצרות של תחומים כרומטין PRC2 מתווכת המהווים H3K27me2/3. מערכת זו שיכולה ללכוד את הפרטים המכניים של היווצרות דומיין כרומטין, יכול להיות מותאם לשלב תחומים כרומטין אחרים, כגון תחומים למדו נרחב הכוללת או H2AK119ub או H3K9me. בשילוב עם טכנולוגיות גנומיקה והדמיה, לגישה זו יש את הפוטנציאל לטפל בהצלחה בשאלות מרכזיות שונות בביולוגיה כרומטין.
Protocol
Representative Results
Discussion
גישה רבת עוצמה כלפי הבנת הפרטים המכניים במהלך היווצרות תחום כרומטין נתון, היא לשבש תחילה את התחום ולאחר מכן לעקוב אחר השיחזור שלה במהלך התאים. התהליך יכול להיות מושהה בכל עת במהלך השיקום כדי לנתח בפרוטרוט את האירועים המתבצעים. המחקרים הקודמים על תחומים כרומטין לא היו מסוגלים לפתור אירועי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר ל. ואלס, ד. Ozata ו-H. Mou לתיקון כתב היד. מעבדת D.R. נתמכת על ידי המכון הרפואי הווארד יוז והמכונים הלאומיים לבריאות (R01CA199652 וR01NS100897).
Materials
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (10×10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
| 2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
| 2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
| Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
| Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
| CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) – 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
| ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
| FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
| GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
| H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
| H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
| Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
| Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
| MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
| Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
| Primers/gBlocks | |||
| EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
| i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
| Genotyping Primers | |||
| Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
| Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
| Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
References
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
- Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
- Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
- Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
- Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
- Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
- Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
- Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
- Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
- Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
- Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
- Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
- Benchling for Academics. Benchling Available from: https://benchling.com (2018)
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90 (2002).
- Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
- . UCSC Genome Browser Home Available from: https://genome.ucsc.edu (2019)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
- Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
- Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).
