Extração de cortisol de matrizes de Sturgeon Fin e Jawbone
Summary
Neste estudo, apresentamos um protocolo de extração de cortisol da barbatana e mandíbula de espécies de esturjão. Os níveis do cortisol da aleta e do Jawbone foram examinados mais adicional comparando dois solventes de lavagem seguidos por ensaios de ELISA. Este estudo pilotou a viabilidade do cortisol do Jawbone como um indicador novo do esforço.
Abstract
Os objetivos deste estudo foram desenvolver uma técnica para a extração de cortisol a partir de barbatanas de esturjão utilizando dois solventes de lavagem (água e isopropanol) e quantificar quaisquer diferenças nos níveis de cortisol Fin entre três espécies principais de esturjão. As barbatanas foram colhidas de 19 esturjão sacrificados, incluindo sete beluga (Huso Huso), sete siberianos (Acipenser baerii), e cinco Sevruga (A. stellatus). Os esturjão foram levantados em fazendas iranianas por 2 anos (2017-2018), e a análise da extração do cortisol foi conduzida em Coreia sul (janeiro-fevereiro 2019). Os Jawbones de cinco H. Huso foram usados igualmente para a extração do cortisol. Os dados foram analisados utilizando-se o procedimento de modelo linear geral (GLM) no ambiente SAS. Os coeficientes de variação intra e inter-ensaio foram de 14,15 e 7,70, respectivamente. Resumidamente, a técnica de extração de cortisol envolveu a lavagem das amostras (300 ± 10 mg) com 3 mL de solvente (água ultrapura e isopropanol) duas vezes, rotação a 80 rpm por 2,5 min, secagem de ar as amostras lavadas à temperatura ambiente (22-28 ° c) por 7 dias, secagem adicional as amostras usando um batedor de talão em 50 Hz para 32 min e moagem-los em pó, aplicando 1,5 mL de metanol para o pó seco (75 ± 5 mg), e rotação lenta (40 rpm) para 18 h em temperatura ambiente com mistura contínua. Após a extração, as amostras foram centrifugadas (9.500 x g por 10 min), e 1 ml de sobrenadante foi transferido para um novo tubo de microcentrífuga (1,5 ml), incubados a 38 ° c para evaporar o metanol e analisados via ensaio IMUNOENZIMÁTICO (ELISA) . Não foram observadas diferenças nos níveis de cortisol Fin entre as espécies ou nos níveis de cortisol de barbatana e mandíbula entre solventes de lavagem. Os resultados deste estudo demonstram que a matriz do Jawbone do esturjão é um indicador alternativo prometedor do esforço às matrizes contínuas.
Introduction
O cortisol é um indicador fiável do stress animal. Extração de cortisol fornece um quadro válido para os pesquisadores para monitorar os níveis de estresse e padrões gerais em estressores. Por exemplo, estudos prévios realizaram validação metodológica de medições de cortisol capilar utilizando vários métodos em humanos1,2, macacos3,4, bovinos5, ovinos6e Goldfish7,8. Em espécies de peixes, as medições de cortisol em matrizes como escalas, muco cutâneo, fezes e sangue9 foram mostradas para fornecer informações sobre a saúde dos peixes. Quando a amostragem de sangue é problemática ou as escalas faltam, matrizes alternativas para a extração do cortisol são necessários. Em peixes, matrizes alternativas podem incluir o osso maxilar, um tecido duro semelhante ao dente humano10.
O desenvolvimento de novas matrizes e técnicas validadas para determinar os níveis de estresse dos peixes é de particular interesse para a indústria de caviar, onde o esturjão pode experimentar exposição prolongada a fatores de estresse ambiental11. O sexo do esturjão não pode ser determinado antes dos 2 anos de idade, e o esturjão não tem escalas. Porque o cortisol se acumula gradualmente em matrizes sólidas durante a fase de crescimento2,7,12, dados de acumulação de cortisol de longo prazo de matrizes duras, tais como barbatanas e Jawbones poderia fornecer insight sobre o stress níveis em diferentes estágios de crescimento. Em contrapartida, os níveis de cortisol no sangue proporcionam um instantâneo dos níveis de estresse no momento da morte e não podem representar com precisão o estresse durante as condições de criação de longo prazo13,14. Com o aumento da concorrência no mercado de caviar, novas abordagens para melhorar as condições de stress para a produção de ovos mais saudáveis entre as espécies de esturjão durante a criação de longo prazo (8-12 anos ou mais) são uma área cada vez mais importante de pesquisa. Devido ao alto custo do esturjão, as amostras colhidas são extremamente dispendiosas ($ 8000-15000 por peixe maduro, dependendo da espécie e do estágio de crescimento), um fator limitante para projetos de pesquisa. No entanto, o desenvolvimento de uma técnica adequada para a extração de cortisol de barbatanas de esturjão e mandíbula poderia ser aplicado de forma útil tanto para sistemas de piscicultura e em peixes selvagens para melhorar a qualidade e colheita de ovos de esturjão para consumo e Conservação.
Além de fornecer resultados confiáveis6, a seleção de uma técnica de extração de cortisol adequada é de importância crucial para garantir que outros compostos presentes na matriz durante a preparação da amostra não confundir a saída, o que pode levar a resultados inconsistentes. É igualmente importante determinar se os níveis de cortisol da aleta e do Jawbone são influenciados pelos níveis hormonais na água circunvizinha. Heimbürge et al.15 sugeriram que uma série de fatores pode influenciar os níveis de cortisol, incluindo idade, sexo, gravidez, estação, cor12e região do corpo a partir do qual o cortisol é extraído16. No entanto, pouca informação está disponível sobre os efeitos da lavagem de solventes na extração de cortisol em matrizes de corpo de peixe8, e nenhum sobre estes efeitos em esturjão, exceto para os ovos de esturjão17.
Embora a análise dos níveis basais de cortisol das barbatanas e mandíbula do esturjão exija que o peixe seja eutanasiado, essa abordagem não implica as técnicas invasivas necessárias para a amostragem de sangue em esturjão vivo. As amostras da aleta e do Jawbone são coletadas facilmente, e a extração destes tecidos pode ser executada ràpida. Da mesma forma, extração e análise hormonal são simples e exigem pouco equipamento especializado.
Neste estudo, apresentamos uma técnica nova e facilmente aplicada para a extração, lavagem e determinação do cortisol a partir de barbatanas de peixe e mandíbula, com o objetivo de determinar se os níveis de cortisol medidos a partir dessas matrizes podem ser utilizados de forma confiável como estresse Indicadores. As vantagens desta técnica incluem uma abordagem fácil e não invasiva8 , menor variação de dados e saída confiável1,6,8,17; a técnica é aplicável a espécies de peixes sem escalas como o esturjão. A técnica requer abate dopeixe, seleçãode solventes de lavagem apropriados2,4, moagemadequada das amostras3,5, ensaio imunoenzimático profissional (ELISA) aplicação5,7e amplo conhecimento da incorporação de fontes de cortisol em matrizes sólidas6.
Aplicamos dois diferentes solventes de lavagem (água ultrapura e isopropanol) para obter níveis de cortisol basal em barbatanas de três espécies de esturjão: beluga (Huso Huso), Siberian (Acipenser baerii) e Sevruga (A. stellatus ), em condições ambientais padrão para cada espécie. Os Jawbones de H. Huso foram usados igualmente para avaliar o esforço no Sturgeon. Este é o primeiro estudo para medir os níveis de cortisol em mandíbula de esturjão. Os resultados deste estudo proporcionarão dados comparativos de cortisol para espécies de esturjão na fase inicial de crescimento (~ 1 ano) antes da determinação do sexo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O esturjão é às vezes chamado de “fóssil vivo” porque exibiu poucas adaptações ao longo dos últimos milênios. O gênero de esturjão Acipenser contém 27 espécies que produzem caviar; no entanto, três espécies (beluga, baerii e Sevruga) produzem a maior parte do suprimento global de caviar. Esturjão são vulneráveis à sobrepesca e interferência em seu habitat natural e, portanto, são mais criticamente ameaçadas do que qualquer outro grupo de espécies. O esturjão pertence ao grupo o mais velho …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi conduzido com o apoio do programa de pesquisa cooperativa de ciência da agricultura & desenvolvimento tecnológico (título do projeto: análise de mudança de produtividade pecuária com mudanças climáticas, projeto n º. PJ012771), administração de desenvolvimento rural, República da Coréia. Além disso, este estudo foi apoiado por uma subvenção (no. PJ01344604) da nutrição animal & equipe de Fisiologia, Instituto Nacional de Zootecnia, RDA, Seul, República da Coréia. Os autores reconhecem com gratidão o CEO do persa gesto Mohammad Hassan Salmanzadeh e sua equipe, que forneceu peixes das três espécies de esturjão examinadas neste estudo.
Materials
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
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