Extracción de cortisol de las matrices de aleta de esturión y mandíbula
Summary
En este estudio, presentamos un protocolo para la extracción de cortisol de la aleta y la mandíbula de las especies de esturión. Los niveles de cortisol de aleta y mandíbula se examinaron más adelante comparando dos disolventes de lavado seguidos de ensayos ELISA. Este estudio pilotó la viabilidad del cortisol maxilar como un indicador de estrés novedoso.
Abstract
Los objetivos de este estudio fueron desarrollar una técnica para la extracción de cortisol a partir de aletas de esturión utilizando dos disolventes de lavado (agua e isopropanol) y cuantificar cualquier diferencia en los niveles de cortisol de aleta entre tres especies principales de esturión. Las aletas fueron cosechadas de 19 esturiones sacrificados, incluyendo siete beluga(Huso huso),siete siberianos(Acipenser baerii)y cinco sevruga (A. stellatus). Los esturiones se criaron en granjas iraníes durante 2 años (2017-2018), y el análisis de extracción de cortisol se llevó a cabo en Corea del Sur (enero-febrero de 2019). Los jawbones de cinco H. huso también se utilizaron para la extracción de cortisol. Los datos se analizaron mediante el procedimiento de modelo lineal general (GLM) en el entorno SAS. Los coeficientes de variación intra y entre ensayos fueron de 14,15 y 7,70, respectivamente. Brevemente, la técnica de extracción de cortisol implicó el lavado de las muestras (300 x 10 mg) con 3 ml de disolvente (agua ultrapura e isopropanol) dos veces, rotación a 80 rpm durante 2,5 min, secado al aire de las muestras lavadas a temperatura ambiente (22-28 oC) durante 7 días, secado posterior las muestras que utilizan un batidor de perlas a 50 Hz durante 32 minutos y la molienda en polvo, aplicando metanol de 1,5 ml al polvo seco (75 x 5 mg), y rotación lenta (40 rpm) durante 18 horas a temperatura ambiente con mezcla continua. Después de la extracción, las muestras se centrifugaron (9.500 x g durante 10 min) y se transfirieron un sobrenadante de 1 ml a un nuevo tubo de microcentrífuga (1,5 ml), se incubaron a 38 oC para evaporar el metanol y se analizaron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) . No se observaron diferencias en los niveles de cortisol de aleta entre las especies o en los niveles de cortisol de aleta y mandíbula entre los disolventes de lavado. Los resultados de este estudio demuestran que la matriz jawbone de esturión es un indicador de tensión alternativo prometedor a matrices sólidas.
Introduction
El cortisol es un indicador fiable del estrés animal. La extracción de cortisol proporciona un marco válido para que los investigadores supervisen los niveles de estrés y los patrones generales en los factores de estrés. Por ejemplo, estudios previos han llevado a cabo la validación metodológica de mediciones de cortisol capilar utilizando diversos métodos en humanos1,2, monos3,4, bovino5, ovejas6, y pecesdorados 7,8. En las especies de peces, se ha demostrado que las mediciones de cortisol en matrices como escamas, moco de la piel, heces y sangre9 proporcionan información sobre la salud de los peces. Cuando el muestreo de sangre es problemático o faltan escamas, se necesitan matrices alternativas para la extracción de cortisol. En los peces, matrices alternativas pueden incluir la mandíbula, un tejido duro similar al diente humano10.
El desarrollo de nuevas matrices y técnicas validadas para determinar los niveles de estrés de los peces es de particular interés para la industria del caviar, donde el esturión puede experimentar una exposición prolongada a los factores de estrés ambiental11. El sexo del esturión no se puede determinar antes de los 2 años de edad, y el esturión no tiene escamas. Debido a que el cortisol se acumula gradualmente en matrices sólidas durante la etapa de crecimiento2,7,12, datos de acumulación de cortisol a largo plazo de matrices duras como aletas y mandíbulas podrían proporcionar información sobre el estrés niveles en diferentes etapas de crecimiento. Por el contrario, los niveles de cortisol en sangre proporcionan una instantánea de los niveles de estrés en el momento de la muerte y no pueden representar con precisión el estrés durante las condiciones de cría a largo plazo13,14. Con la creciente competencia en el mercado del caviar, los nuevos enfoques para mejorar las condiciones de estrés para la producción de huevos más saludables entre las especies de esturión durante la cría a largo plazo (8-12 años o más) son un área de investigación cada vez más importante. Debido al alto costo del esturión, las muestras cosechadas son extremadamente costosas ($8,000-15,000 por peces maduros dependiendo de la especie y la etapa de crecimiento), un factor limitante para los proyectos de investigación. Sin embargo, el desarrollo de una técnica adecuada para la extracción de cortisol a partir de aletas de esturión y mandíbulas podría aplicarse útilmente tanto a los sistemas de piscicultura como a los peces silvestres para mejorar la calidad y la cosecha de huevos de esturión tanto para el consumo como para Conservación.
Además de proporcionar resultados fiables6, la selección de una técnica de extracción de cortisol adecuada es de importancia crítica para garantizar que otros compuestos presentes en la matriz durante la preparación de la muestra no confundan la producción, lo que podría resultados incoherentes. Es igualmente importante determinar si los niveles de cortisol de aleta y mandíbula están influenciados por los niveles hormonales en el agua circundante. 15 sugirieron que una serie de factores pueden influir en los niveles de cortisol, incluyendo la edad, el sexo, el embarazo, la temporada, el color12y la región corporal de la que se extrae el cortisol16. Sin embargo, se dispone de poca información sobre los efectos de los disolventes de lavado en la extracción de cortisol en matrices de cuerpo de pescado8, y ninguno sobre estos efectos en el esturión, excepto para los huevos de esturión17.
Aunque el análisis de los niveles basales de cortisol a partir de las aletas y mandíbulas del esturión requiere que el pez sea eutanasiado, este enfoque no implica las técnicas invasivas necesarias para el muestreo de sangre en el esturión vivo. Las muestras de aleta y mandíbula se recogen fácilmente, y la extracción de estos tejidos se puede realizar rápidamente. Del mismo modo, la extracción y el análisis hormonales son sencillos y requieren poco equipo especializado.
En este estudio, presentamos una técnica nueva y fácil de aplicar para la extracción, lavado y determinación de cortisol a partir de aletas de pescado y mandíbulas, con el objetivo de determinar si los niveles de cortisol medidos a partir de estas matrices pueden utilizarse de forma fiable como estrés Indicadores. Las ventajas de esta técnica incluyen un enfoque8 fácil y no invasivo, menos variación de datos y una salida confiable1,6,8,17; la técnica es aplicable a especies de peces sin escamas como el esturión. La técnica requiere el sacrificio del pescado, la selección de los disolventes de lavado adecuados2,4, molienda adecuada de las muestras3,5, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas profesionales (ELISA) aplicación5,7, y un amplio conocimiento de la incorporación de fuentes de cortisol en matrices sólidas6.
Aplicamos dos disolventes de lavado diferentes (agua ultrapura e isopropanol) para obtener niveles basales de cortisol en aletas de tres especies de esturión: beluga (Huso huso), siberiano (Acipenser baerii) y sevruga (A. stellatus ), en condiciones ambientales estándar para cada especie. Mandíbulas de H. huso también se utilizaron para evaluar el estrés en el esturión. Este es el primer estudio para medir los niveles de cortisol en los maxilares de esturión. Los resultados de este estudio proporcionarán datos comparativos de cortisol para las especies de esturión en la etapa de crecimiento temprano (1 año) antes de la determinación del sexo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El esturión a veces se llama un “fósil viviente” porque ha exhibido pocas adaptaciones a lo largo de los últimos milenios. El género de esturiones Acipenser contiene 27 especies que producen caviar; sin embargo, tres especies (beluga, baerii y sevruga) producen la mayor parte del suministro mundial de caviar. El esturión es vulnerable a la sobrepesca y a la interferencia en su hábitat natural y, por lo tanto, está en peligro de extinción más crítico que cualquier otro grupo de especies. El esturión pe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo se llevó a cabo con el apoyo del Programa de Investigación Cooperativa para el Desarrollo de La Ciencia y Tecnología Agrícola (Título del Proyecto: Análisis del cambio de productividad ganadera con cambio climático, Proyecto No. PJ012771), Administración de Desarrollo Rural, República de Corea. Además, este estudio fue apoyado por una subvención (No. PJ01344604) del Equipo de Nutrición y Fisiología Animal, Instituto Nacional de Ciencias Animales, RDA, Seúl, República de Corea. Los autores reconocen con gratitud al CEO de Persian Gesture Mohammad Hassan Salmanzadeh y a su equipo, que proporcionó peces de las tres especies de esturión examinadas en este estudio.
Materials
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
References
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
- Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
- Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
- Brossa, A. C. . Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , (2018).
- Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
- Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
- Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240 (2016).
- Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
- Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
- Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
- Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411 (2015).
- Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
- Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
- SAS. 1999. . SAS. User’s Guide (Version 8.01 Edition). , (1999).
- Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).
