Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Jason E Chung; Hannah  R Joo; Clay  N Smyth; Jiang Lan Fan; Charlotte Geaghan-Breiner; Hexin Liang; Daniel  Fan Liu; Demetris Roumis; Supin Chen; Kye  Y Lee; Jeanine  A Pebbles; Angela  C Tooker; Vanessa  M Tolosa; Loren  M Frank

doi:10.3791/59957

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Neuroscience

Implantación Crónica de Múltiples Matrices de Electrodos Flexibles de Polímeros

Published: October 04, 2019

doi:

10.3791/59957

Jason E Chung*^1,2, Hannah R Joo*^1,2, Clay N Smyth², Jiang Lan Fan³, Charlotte Geaghan-Breiner², Hexin Liang², Daniel Fan Liu³, Demetris Roumis², Supin Chen^4,5, Kye Y Lee⁴, Jeanine A Pebbles⁴, Angela C Tooker⁴, Vanessa M Tolosa^4,5, Loren M Frank^2,6

¹Medical Scientist Training Program and Neuroscience Graduate Program,University of California San Francisco, ²Kavli Institute for Fundamental Neuroscience, Center for Integrative Neuroscience, and Department of Physiology,University of California San Francisco, ³Bioengineering Graduate Program,University of California San Francisco, ⁴Center for Micro- and Nanotechnology,Lawrence Livermore National Laboratory, ⁵Neuralink Corp., ⁶Howard Hughes Medical Institute

Summary

A continuación se describe un método para la implantación de múltiples matrices de electrodos de polímeros en regiones cerebrales anatómicamente distantes para la grabación electrofisiológica crónica en ratas que se mueven libremente. La preparación y la implantación quirúrgica se describen en detalle, con énfasis en los principios de diseño para guiar la adaptación de estos métodos para su uso en otras especies.

Abstract

Las grabaciones simultáneas de grandes poblaciones de neuronas individuales en regiones cerebrales distribuidas a lo largo de meses a años permitirán nuevas vías de desarrollo científico y clínico. El uso de matrices flexibles de electrodos de polímero puede soportar la grabación de larga duración, pero las mismas propiedades mecánicas que permiten la longevidad de la grabación hacen que múltiples inserciones e integración en un implante crónico sean un desafío. Esta es una metodología mediante la cual múltiples matrices de electrodos de polímeros pueden ser dirigidas a un conjunto relativamente espacialmente sin restricciones de áreas cerebrales.

El método utiliza dispositivos de polímero de película delgada, seleccionados por su biocompatibilidad y capacidad para lograr interfaces de grabación electrofisiológicas estables y a largo plazo. El implante resultante permite una focalización precisa y flexible de regiones anatómicamente distantes, estabilidad física durante meses y robustez al ruido eléctrico. La metodología admite hasta dieciséis dispositivos insertados en serie en ocho objetivos anatómicos diferentes. Como se ha demostrado anteriormente, la metodología es capaz de grabar desde 1024 canales. De ellos, los 512 canales de esta demostración utilizados para la grabación de una sola neurona produjeron 375 unidades individuales distribuidas en seis sitios de grabación. Es importante destacar que este método también puede registrar unidades individuales durante al menos 160 días.

Esta estrategia de implantación, que incluye el refuerzo temporal de cada dispositivo con un transbordador de inserción de silicio retráctil, implica el amarre de dispositivos en sus profundidades objetivo a una pieza base de plástico adherida al cráneo que está diseñada a medida para cada conjunto de grabación objetivos, y la estabilización / protección de los dispositivos dentro de una caja de plástico llena de silicona, diseñada a medida. También se cubre la preparación de dispositivos para la implantación, y principios de diseño que deben guiar la adaptación a diferentes combinaciones de áreas cerebrales o diseños de arreglos de discos.

Introduction

Un implante neural ideal registraría de un gran número de neuronas individuales en áreas cerebrales distribuidas durante semanas a meses. Las matrices flexibles de electrodos de polímero proporcionan grabaciones electrofisiológicas con la longevidad para grabar durante meses y la estabilidad para rastrear neuronas individuales¹^,²^,³. Sin embargo, las mismas propiedades mecánicas que reducen el daño por cizallamiento⁴ y confieren biocompatibilidad y capacidad de grabación²^,³^,⁵^,⁶^,⁷^, ⁸ plantean un desafío a su inserción en el cerebro en relación con sus contrapartes rígidas. El trabajo anterior realizó un máximo de cuatro matrices de 32 canales, pero el rendimiento total de las neuronas individuales putativas ordenadas no se reporta²^,³^,⁹. Por el contrario, las matrices de electrodos basadas en silicio se han utilizado en implantes de alta densidad y de varias regiones, pero estas tecnologías carecen de la capacidad de registrar picos de neuronas durante meses (longevidad) o de rastrear las mismas neuronas (estabilidad) en esa escala de tiempo, o la densidad para registrar de cientos de neuronas individuales a través de múltiples regiones cerebrales. El método presentado aquí supera el bajo número de inserciones en los métodos actuales basados en la matriz de electrodos de polímeros, proporcionando así medios para el registro electrofisiológico de grandes cantidades de neuronas individuales en múltiples regiones anatómicamente distantes para meses, con la estabilidad para registrar de las mismas neuronas individuales a lo largo de muchos días.

Existe cierto debate sobre la importancia de utilizar un sustrato de polímero en lugar de estrategias basadas en microhilos o silicio. Como lo demuestraN Dhawale et al.¹⁰, los microcables son realmente capaces de grabaciones estables de meses de duración en roedores, aunque los implantes se limitaron a 16 tetrodes en una sola región. Escalar el tamaño del implante de microhilo alcanza un límite superior relativamente alto, con hasta 1792 canales implantados alcanzados en un primate no humano^11. Sin embargo, la construcción de los arreglos de microhilos es incompatible con los procesos de nanofabricación de silicio y, por lo tanto, requiere un manejo manual de cada canal individualmente durante la construcción^12,¹³ ^,¹⁴. Como tal, no está claro si esta tecnología podría soportar un orden de aumento de magnitud en los canales de grabación.

Los dispositivos de silicio actuales pueden colocar cientos o incluso más de mil electrodos en un solo dispositivo monolítico¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Los últimos procesos de fabricación de silicio generan dispositivos con áreas transversales más pequeñas, independientemente del material, lo que resulta en menos activación glial²⁰^,²¹^,²²^,²³ ^,²⁴ y más dispositivos compatibles. Hay una variabilidad en los informes de la sonda de silicio de una sola unidad que registra la longevidad, con algunos indicando que las sondas de silicio relativamente grandes pueden proporcionar la grabación a largo plazo^25,²⁶. En particular, los últimos dispositivos de silicio disponibles comercialmente¹⁷ tienen la longevidad para grabar durante varios meses y tienen áreas transversales muy similares a los vástagos utilizados en el método descrito aquí (Jun et al. 2017¹⁷: 70 ám x 20 m, dispositivos descritos aquí y en Chung et al. 2019¹: 68 m – 80 ám x 14 m). Debido a la diferencia en la estabilidad, esta sonda no se ha demostrado para ser capaz de grabar desde las mismas neuronas durante semanas. Esto probablemente se debe a alguna combinación del uso de silicio rígido, así como el anclaje directo al cráneo, conocido por causar micromoción, inestabilidad y gliosis en la interfaz array-brain^27,²⁸. Para construir un dispositivo que se pueda mover con el tejido neural, se requieren materiales que sean blandos^5,²⁹ y^{flexibles 7.} Muchos polímeros disponibles (véanse Geddes y Roeder³⁰, Fattahi et al.³¹, y Weltman et al.³² para revisiones) tienen la flexibilidad y estabilidad de los microhilos y también son compatibles con los procesos de nanofabricación, que permiten el empaque denso de dispositivos de silicio.

Varios problemas de implantación neuronal son específicos para el uso de matrices flexibles de electrodos de polímeros. El primero de ellos es la inserción de la matriz, ya que los arreglos flexibles carecen de la rigidez para ser avanzados en el cerebro como estrategias basadas en silicio o microcables. La mayoría de las estrategias de inserción para dispositivos flexibles dependen de un endurecimiento temporal del sustrato como se hace en este método (ver Weltman et al.³² para su revisión). Hay cinco estrategias notables que no hacen uso de un transbordador rígido. En primer lugar, existen métodos que hacen uso de materiales que pasan de rígidos a obedientes tras la implantación³³^,^34. Un inconveniente de esta estrategia es que requiere un área transversal relativamente grande para lograr la fuerza necesaria para la penetración del tejido cerebral antes de pandeo según lo dictado por el cálculo de la fuerza de pandeo de Euler³⁵. Este aumento en el área transversal afectará negativamente la salud del tejido circundante²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴. En segundo lugar es el uso de una estructura de soporte extraíble por encima del cerebro^36,aunque esto requiere la eliminación o disolución lenta del andamio para mantener una longitud mínima no soportada (y alta fuerza de pandeo). Alternativamente, requeriría que la matriz se inserte con una longitud no soportada más larga, lo que requeriría un sustrato de matriz más rígido o un área de sección transversal de matriz más grande. En tercer lugar se encuentra la prepenetración para abrir un agujero para que la matriz flexible se inserte después^{de 35}. Esto requiere un realineamiento preciso o un diámetro de prepenetración relativamente grande, y rigidez de matriz de electrodos y área transversal para permitir la inserción no admitida. Cuarto es el uso de recubrimientos disueltos para endurecer el dispositivo flexible. Esto aumenta significativamente el área transversal y el daño agudo causado por la inserción, incluso cuando se toman precauciones especiales para preservar la punta afilada de un dispositivo^37. Quinto es la inyección de la matriz de polímeros. Esta estrategia ha tenido éxito en la consecución de implantes con hasta cuatro inserciones de 32 canales², pero requiere el uso de un área transversal mucho más grande para la inserción, un tubo capilar de vidrio de 250 m – 1,5 mm de diámetro exterior^9,causando un mayor daño agudo. Por el contrario, el uso de un trans bordador extraíble, al tiempo que se añade área transversal a la inserción aguda, permite el uso de los materiales más rígidos posibles y, por lo tanto, puede ser el tamaño mínimo teórico al insertar un dispositivo arbitrariamente flexible. Por lo tanto, la inserción mediante un trans bordador rígido es actualmente la opción más atractiva para insertar dispositivos flexibles.

Hay dos requisitos de cualquier enfoque de transbordador de inserción: un sustrato adecuadamente rígido y una manera de acoplar el dispositivo flexible al sustrato. Los materiales de transporte de inserción son típicamente silicio^38,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹, acero inoxidable⁸^,^42,o tungsteno⁴³^,⁴⁴^, ⁴⁵, con materiales más rígidos que permiten áreas transversales más pequeñas. Por lo general, se fijan utilizando un adhesivo como el polietilenglicol (PEG)⁸^,³⁸^,³⁹^,⁴²^,⁴³, fuerzas electrostáticas^40,o directos acoplamiento físico⁴⁵^,⁴⁶. En todos los casos, los desafíos son la alineación y acoplamiento de la matriz de electrodos y el transbordador de inserción antes de la inserción y desacoplamiento después de la inserción. A continuación se muestra un refinamiento del método introducido por Felix et al.³⁹ para sujetar temporalmente la matriz de electrodos con un transbordador de inserción de silicio, unido mediante PEG, que se elimina después de la inserción de la matriz a su profundidad de destino.

Un segundo desafío presentado por dispositivos flexibles dentro de un implante crónico es el de estabilizar el dispositivo dentro del cerebro mientras que todavía permite que el dispositivo se integre en un implante unido al cráneo. El cerebro se mueve en relación con el cráneo debido a pulsaciones naturales, cambios edematosos postraumáticos, impacto y otras causas, y la matriz de electrodos debe ser por lo menos algo libre para moverse en relación con donde se fija al cráneo y al hardware de grabación. Esto se logra utilizando una pieza base de plástico impresa en 3D, diseñada a medida para cada conjunto de objetivos de implante, que tiene múltiples funciones: un depósito salino durante la implantación, ubicación para amarre las matrices de polímeros, y la carcasa para gel de silicona. La ubicación de anclaje por encima del cráneo y el gel de silicona trabajan juntos para crear un mayor radio de curvatura para la matriz y así permitir fuerzas de compresión más grandes en la matriz. Esto a su vez permite que el movimiento del cerebro en relación con los puntos de anclaje de la matriz (cráneo) se traduzca en carga de pandeo.

Otros desafíos incluyen la necesidad de albergar múltiples matrices y proporcionar un amplio alivio de la tensión para que el animal se comporte libremente sin transferencia de vibraciones o fuerzas de impacto a las matrices de electrodos, lo que puede causar movimiento en relación con el tejido neural. Las adaptaciones a soluciones que se han utilizado en aplicaciones similares donde el cerebro debe ser estable en relación con una ventana de grabación rígida han abordado este desafío. Un gel de silicona sellador dural artificial(Tabla de materiales),que previamente se ha demostrado que no es tóxico y evita la fuga de LSC^47,proporciona contrapresión al cerebro para prevenir la hinchazón externa y estabilizar la matriz en la superficie cerebral. Una capa adicional de protección se añade a las cintas del dispositivo por el elastómero de silicona de grado quirúrgico de viscosidad media, previamente demostrado para su uso en el sellado de implantes de electrodos neurales crónicos^48. Por último, el implante y el escenario con búfer de silicona están revestidos con piezas impresas en 3D diseñadas a medida para mantener un centro de masa bajo para una reducción mínima de la movilidad normal del animal.

Este protocolo comienza con una matriz flexible de microelectrodos de polímero montada en un transbordador de inserción de silicio. Procede con el montaje del dispositivo de transporte de matriz a las piezas de inserción impresas en 3D, describe la técnica quirúrgica y los pasos de construcción del implante necesarios para implantar con éxito un animal, y es capaz de soportar dieciséis polímeros multielectrodo matrices implantadas en ocho regiones anatómicamente distantes en una sola rata¹.

Este protocolo asume los materiales de partida de las matrices de electrodos de polímero sin conexión por el polietilenglicol adhesivo biodisoluble (PEG) a un transbordador de inserción de silicio, como se muestra en Felix et al.³⁹, y al menos dos inserciones móviles independientes piezas: una a la que se pegará el transbordador de silicio y otra a la que se adirá el conector de la matriz de electrodos. Este protocolo también utiliza una tercera pieza de inserción para fijar de forma más segura las dos piezas de inserción a un micromanipulador a escala de micrones. Todos los archivos para impresión 3D se pueden encontrar en: https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3DParts

Cada matriz de electrodos de polímero, utilizada en este método, se compone de dos a cuatro vástagos de grabación, una cinta que transporta las trazas eléctricas y, al final de la cinta, un conector de hardware o placa de circuito impreso. La matriz de electrodos y la cinta se fijan sobre el transbordador de silicio con PEG. Cada cinta tiene un tubo de poliimida de 2 cm de largo x 1 mm de espesor unido a la cinta a través de epoxi curable UV, que se extiende perpendicular a la longitud de lacinta. Cada dispositivo (matriz de electrodos y transbordador de inserción) debe cargarse en las piezas de inserción impresas en 3D que se utilizarán para insertar la matriz en el cerebro y retirar el trans bordador(Figura 1). En este diseño, el micromanipulador de inserción hidráulica (verde, Tabla de materiales)mueve todo el aparato de inserción (pieza 1, pieza 2 y el micromanipulador de retracción, naranja) a su profundidad objetivo. Una vez que la matriz se ha separado del aparato de inserción y fija, el segundo micromanipulador de retracción (naranja) retrae la pieza 1 y el trans bordador conectado independientemente del resto del aparato de inserción, retirando el trans bordador sin desplazar la matriz.

Figura 1: Componentes del insertador.
(A) Las piezas 1 y 2 se fijan temporalmente entre sí con un tornillo extraíble y más tarde se acoplarán al pistón del micromanipulador de retracción (naranja). (B) La matriz y el transbordador de inserción se adhieren a la pieza 1 y el conector de la matriz se une a la pieza 2 con cinta adhesiva de doble cara. La pieza 3 conecta el micromanipulador de retracción y las piezas 1 y 2 al micromanipulador de inserción (verde). El micromanipulador de inserción se fija a un adaptador estereotáctico para el posicionamiento del implante. Las piezas 1-3 se muestran en sus tamaños relativos. La pieza 4 es una pieza estabilizadora para una alineación adecuada de la lanzadera de inserción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

Todos los protocolos relacionados con animales descritos en este manuscrito han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la UCSF. 1. Preparación de matrices de electrodos de polímero para la inserción (30 min) Fije la pieza 1 a la pieza 2 insertando un tornillo a través de agujeros alineados y orientados verticalmente para bloquear las piezas(Figura 2). Sostenga estas dos piezas en un vicio. Coloque la cinta de doble cara(Tabla de materiales)en la parte superior de la pieza 2. Fije la pieza estabilizadora 4 al final de la pieza 1. Se mantendrá en su lugar por fricción. Figura 2: Montaje para la alineación de matriz-shuttle.(A) Montaje de piezas 1, 2, y pieza estabilizadora en preparación del accesorio de transporte de inserción. (B) Piezas 1 y 2 sujetas juntas con el tornillo del pulgar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. A mano, alinee la matriz de electrodos y conecte el transbordador de inserción con el segmento de extremo estrecho de la pieza 1. Cuando la sonda esté alineada con el eje longitudinal de la pieza 1, adhiera el conector de matriz a la cinta de doble cara de poliimida en la parte plana de la pieza 2. Con fórceps con punta de plástico, entrando sólo en contacto con el ala de poliimida unida a la cinta de matriz, levante la punta del dispositivo de matriz de electrodos de transbordo de inserción de la pieza 1, al exterior de la piezaestabilizadora (Figura 3A). Aplique una pequeña cantidad de cianoacrilato(Tabla de Materiales)u otro adhesivo (-10 l) al final de la pieza 1. Demasiado poco no se adhiere fuertemente el trans bordador de inserción a la pieza 1, arriesgando el desprendimiento durante la inserción o la retracción. Demasiado corre el riesgo de desbordar el trans bordador y adherir se adhiere a la matriz en sí a la pieza 1. Usando fórceps con punta de plástico, entrando en contacto sólo con el ala de poliimida unida a la cinta de matriz, vuelva a alinear el dispositivo con el segmento estrecho de la pieza 1, con la pestaña cuadrada de la lanzadera de inserción (y sólo el volante) sobre el pegamento(Figura 3B). Realice pequeños ajustes de alineación manipulando el lado de la lanzadera de silicio o el PEG. Evite aplicar fuerza excesiva a la cinta o vástagos. Figura 3: Alineación, fijación y esterilización de la matriz-shuttle.(A) Orientación adecuada del dispositivo de matriz de electrodos de transbordo de inserción para la aplicación de pegamento en la estación de acoplamiento de la pieza 1. Se muestra el transbordador de dos vástagos. (B) Matriz de electrodos de polímero y lanzadera de inserción montados en la pieza de inserción, con pieza estabilizadora temporal para la alineación. Se muestra el transbordador de dos vástagos. (C) Dispositivo de inserción encerrado en caja de plástico para protección durante la esterilización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Aplique una suave presión hacia abajo con fórceps a ambos lados de la pieza estabilizadora y retírela del conjunto sin mover la matriz. Retire el conjunto del dispositivo montado (piezas 1 y 2, matriz, lanzadera de inserción y conector de matriz) del vicio y adpírelo con cinta adhesiva de doble cara a la base de una pequeña caja de plástico para su esterilización por óxido de etileno(Figura 3C). La esterilización por vapor no es adecuada para estos dispositivos. 2. Diseño de la pieza base Determinar los tamaños de la craneectomía para objetivos estereotácticos seleccionados, así como ubicaciones de tornillos de cráneo y tornillos de tierra. El tamaño de la craneectomía está determinado por la huella de la matriz, con unos pocos cientos (300 euros) de circunferencia micra para los ajustes de colocación para evitar la vasculatura superficial. Usando un software de diseño (por ejemplo, CAD), diseñe la huella de la pieza base para rodear las cranetomías planificadas y encajar dentro del perímetro definido por la cresta temporal y los tornillos del cráneo, maximizando el área de superficie del cráneo que estará fuera de la pieza base a la que cemento adhesivo puede unirse para adherir el implante al cráneo. Contornee la superficie inferior de la pieza base para que pueda adherirse al cráneo sin huecos, reduciendo la posibilidad de infección y evitando que la salina o el elastómero de silicona se vean. Ajuste la altura de la pieza base a 3-7 mm, lo suficientemente alta como para sostener el elastómero de salina y silicona, pero lo suficientemente baja como para no impedir la visibilidad durante la inserción de la matriz.NOTA: La pieza base se puede diseñar con postes verticales o características similares a las que las alas de poliimida se pueden ateaen en un punto superior al cráneo. No permita que los puntos de fijación impidan la vista. Imprima en 3D la pieza base(Figura 4)y esterilice la pieza base antes de la implantación. Figura 4: Cráneo preparado para el implante.Durectomies completas con tornillos de cráneo, capa de acrílico base y pieza base fija al cráneo. 3. Preparación del cráneo (2 h) Seleccione una rata de 400 g o superior para soportar el peso del implante. Se utilizaron ratas macho Long-Evans, a los 6-12 meses de edad. Anestesia a la rata. Coloque el animal en una cámara de anestesia. Activa el 5% de isoflurano. Inyectar una dosis intraperitoneal de ketamina (50 mg/kg), xilazina (6 mg/kg) y atropina (0,14 mg/kg). Controlar la profundidad de la anestesia cada 20 minutos durante todo el procedimiento verificando que no hay abstinencia de pellizcar la pata y la frecuencia respiratoria permanece 50-75 respiraciones / min. Aplique pomada para los ojos a la rata. Afeitar la cabeza de la rata. Coloque el animal en el soporte de esteretaxic. Preparar el sitio quirúrgico fregando con tres exfoliantes alternos cada uno de exfoliación quirúrgica de povidona-yodo, seguido de solución salina estéril. Inyectar 0,2 cc de lidocaína al 0,5% en el cuero cabelludo. Hacer una incisión sagital en la línea media del cráneo exponiendo al menos 3 mm antes de la bregma y 3 mm posterior a la lambda. Retire el periosteum con hisopos de algodón. Marque los sitios de inserción y craneectomía anotando el cráneo con un bisturí usando un plano de coordenadas cartesianas a cero en el bregma con un instrumento estereotáctico. Taladre los sitios de la craniectomía, dejando una capa delgada de hueso que se puede extirpar con fórceps. No exponga dura. Esto permite limpiar el cráneo del polvo óseo sin interrumpir la dura. Taladre e inserte tornillos óseos, uno a la vez, para evitar que el polvo óseo entre en los agujeros. Utilice un riego isotónico generoso para eliminar el polvo óseo. Para un implante de aproximadamente 50 gramos, utilice 10-12 tornillos. Tornillos de titanio permiten la osteointegración49. Avanza los tornillos a una profundidad que penetra completamente el cráneo sin afectar el cerebro. Conecte al menos un tornillo óseo a un cable conductor eléctrico para que funcione como un terreno de circuito. Una vez completada la perforación, limpie el cráneo del polvo óseo con un lavado salino. Seque el cráneo con hisopos de algodón u otros absorbentes y aplique una capa inicial de cemento adhesivo(Tabla de materiales)a los tornillos (no utilice esmalte etchant en el cráneo de roedores). Esta capa preliminar de cemento adhesivo aumentará la adhesión del implante y disminuirá el trabajo de parto en pasos de adhesión posteriores. Retire la capa delgada de hueso que queda en cada sitio de la craneectomía. Incise dura usando una aguja de calibre 30 con una punta doblada mientras evita cualquier vasculatura. La longitud de la incisión coincide con las dimensiones del transbordador de inserción. Si hay sangrado, irrigar manualmente con un goteo suave de salina y no continúe hasta que el sangrado haya cesado. Si se realizan varias durectomías, mantenga los sitios húmedos con espuma de gel u otro método, como el riego regular cada pocos minutos con salina a temperatura corporal. Seque el cráneo de nuevo con hisopos de algodón u otros absorbentes en preparación para la adhesión de cemento de la pieza base al cráneo. Coloque la pieza base estéril. Si la pieza base cubrirá el bregma, marque otra ubicación a una distancia conocida como proxy. Aplique cemento adhesivo alrededor del perímetro de la pieza base. Llene la pieza base adherida con salina; identificar y parchear cualquier fuga con cemento adhesivo en la interfaz entre la pieza base y la interfaz del cráneo (Figura 5).NOTA: Es crucial que la pieza base esté completamente asegurada al cráneo para evitar fugas del gel de silicona sellador dural artificial, ya que esto evitará una adecuada adhesión del implante al cráneo. El animal está listo para tener matrices insertadas. 4. Inserciones en serie de matrices y retracciones de lanzaderas (1 h por matriz) NOTA: Este procedimiento debe ser pilotado con un dispositivo no viable, especialmente para implantes de múltiples matrices donde un dispositivo puede interferir con la implantación de dispositivos posteriores. Cargue las piezas 1 y 2 en el pistón del micromanipulador de retracción. Coloque el micromanipulador de la pieza 1 en una posición extendida y el micromanipulador de la pieza 3 en una posición retraída. El pistón se deslizará a una profundidad de terminal dentro de la pieza 1. La pieza 2 se ajusta dentro de la parte superior de la pieza 3, con los agujeros alineados. Cargue la pieza 3 en el pistón del micromanipulador de inserción y fije en su lugar con un tornillo en la parte inferior de la pieza 3(Figura 5A,B). Cargue y atornille las piezas 2 y 3 juntas, de modo que mover el micromanipulador de inserción mueva todo el aparato de inserción(Figura 5C). Retire el tornillo que sujeta las piezas 1 y 2 juntas. La pieza 1 se mueve independientemente de la pieza 2, para permitir la retracción separada del trans bordador de inserción del aparato. Inserte este tornillo en el orificio lateral de la pieza 1, perpendicular a la pista del pistón, hasta que el tornillo aplique presión sobre el pistón. Esto asegura que la pieza 1 se mueve de acuerdo con el pistón retráctil, como se ve en la Figura 5D. Asegúrese de elegir el orificio lateral que no impida la visión cuando el aparato esté montado en el instrumento estereotáctico. Figura 5: Montaje del insertador.(A) Montaje de la pieza 3 a micromanipuladores. (B) Fijación de las piezas 1 y 2 sobre el aparato de inserción. (C) Piezas de inserción con dispositivo de transbordador de inserción de matriz de electrodos montado. (D) Pieza de sujeción del tornillo del pulgar 1 y 2 juntas retiradas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Retire cualquier espuma de gel de las cranetomías. Utilice el bregma real o proxy para la segmentación estereotáctica. Al mover el dispositivo al sitio de inserción, mantenga una altura de al menos unos pocos centímetros por encima del cráneo. Evite períodos prolongados del dispositivo de transporte de matriz cerca del cráneo o del cerebro para disminuir las posibilidades de que la condensación desenganche la matriz del transbordador de inserción antes o durante la inserción. Si esto ocurre, intente elevar el dispositivo de transporte de matriz por encima del cerebro y el cráneo y espere a que se seque y vuelva a adherirse. Ajuste las coordenadas del implante para evitar la vasculatura superficial. Al igual que durante la craneectomía y la durectomía, evita penetrar los vasos directamente. Inserte el dispositivo rápidamente (25 m/s), bajando con el instrumento estereotáctico hasta que el dispositivo entre en el cerebro. El dispositivo no penetrará el cerebro inmediatamente. El grado de resistencia y hoyuelos dependerá de la ubicación objetivo y el diseño del dispositivo (por ejemplo, dos frente a cuatro vástagos, ángulo de punta), pero el hoyuelo no suele superar 1 mm(Figura 6). Figura 6 : Inserción de arreglo de matriz.El transbordador de matriz se avanza en el cerebro para apuntar a la profundidad. Se muestra el transbordador de cuatro vástagos. Una vez en el cerebro, más bajo con micromanipulador, disminuyendo la velocidad al acercarse a la profundidad objetivo: Utilice el brazo estereotáctico para comenzar a insertar a 25 m/s. Utilice el micromanipulador para insertar a 10 mm/s cuando estén de 2 mm a 1 mm por encima de la profundidad objetivo. Inserción lenta con micromanipulador a 5 m/s cuando entre 1 mm y 500 m por encima de la profundidad objetivo. Inserción lenta más a 1-2 m/s durante los 500 m finales al objetivo. Visualice las alas del dispositivo (tubo horizontal de poliimida) y el punto de inserción durante la bajada para evitar el desprendimiento prematuro de la matriz de transporte. Cuando se haya alcanzado la profundidad objetivo(Figura 7A),ancle bilateralmente las alas de poliimida a los sitios de fijación de la pieza base a través de acrílico curable a la luz u otro adhesivo como cianoacrilato(Tabla de materiales). Secar, si es necesario, las alas o el punto de unión en la pieza base, ya que la condensación puede acumularse en estas superficies y evitar la adhesión. Si la visibilidad u otras restricciones de espacio requieren, el anclaje en un solo ala de poliimida suele ser suficiente. Antes de la disolución, el PEG aparecerá como una masa globular sentada encima de la interfaz del transbordador de matriz e inserción(Figura 7A). Disuelva PEG goteando suavemente la solución salina de temperatura corporal en la matriz en el punto donde se adhiere a la lanzadera. El tiempo que esto requiere dependerá del peso molecular del PEG seleccionado y la disolución completa se puede verificar con visualización directa. Cuando el PEG haya disuelto completamente los límites de las matrices serán completamente discernibles de la lanzadera y la pieza 1(Figura 7B). Figura 7: Retracción del transbordador.(A) Tethering of wings before retraction. Se muestra la matriz de dos vástagos y el trans bordador. (B) Disolución PEG y adhesión del ala con función de vástago (círculo, azul) que permite la confirmación visual del desacoplamiento exitoso de la matriz y el transbordador durante la retracción. (C) Una inserción correcta de la matriz después de que se haya retraído el trans bordador de inserción. (D) Pieza base con rellenos de gel de silicona para una sola inserción de matriz de dos vástagos. El gel de silicona de baja viscosidad utilizado tiene un tinte azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Con el micromanipulador de retracción, retire lentamente el trans bordador de inserción. Continúe el riego salino (1 gota/s) sobre la matriz que se está retrayendo. Utilice velocidades de retracción que sean las mismas que la velocidad de inserción a distancias relevantes desde la profundidad objetivo: Retraer utilizando el micromanipulador a 1-2 m/s desde la profundidad objetivo hasta -500 m. Acelere la retracción utilizando el micromanipulador a 5 m/s cuando -500 ám a -1 mm. Acelere la retracción utilizando el micromanipulador a 10 m/s cuando -1 mm a -2 mm. Retírese usando el brazo estereotáctico a 25 mm/s desde -2 mm desde el objetivo y hacia arriba. Visualice la interfaz entre la matriz y el transbordador de inserción durante la retracción. La matriz de polímeros se separará visiblemente del translúcido y aparecerá translúcida a medida que el transbordado se retraiga en la unión semicircular entre los vástagos de la lanzadera de inserción(Figura 7B). Retire el conector de matriz de la pieza 2 y muévalo a una ubicación que no interfiera con las inserciones posteriores. La matriz de electrodos de polímero está ahora en el cerebro y ya no está conectada al instrumento estereotáctico(Figura 7C). Retire el trans bordador de inserción y otro hardware de inserción. Para múltiples inserciones, repita los pasos 4.1-4.9; no pase a la siguiente sección hasta que se inserten todas las matrices deseadas. Se recomienda insertar dos dispositivos dentro de 250 m uno del otro, ya que la ligera inclinación de la cinta del dispositivo entre el cerebro y las alas en la región de alivio de tensión puede extenderse al menos hasta aquí. 5. Construcción del implante (2 h) Después de la inserción final de la matriz, vacíe la salina de la pieza base usando una pipeta o un hisopo de algodón, teniendo cuidado de no interrumpir los arreglos o cintas implantadas. Llene las cranetomías y la pieza base con elastómero de silicona de baja viscosidad u otro sellador dural artificial. Dejar que se cure(Figura 7D). Con varias inserciones, coloque los conectores de hardware donde no interfieran(Figura 8A). Orientar adecuadamente los conectores de la matriz, y construir el implante, por lo que las cintas están en su posición final deseada. Cubra las matrices, cintas de matriz y conectores en elastómero de silicona de viscosidad media. Preste especial atención a la interfaz de conector de polímero, ya que esta interfaz de material blando-duro es propensa a sufrir daños. Cubra completamente las cintas de la matriz de tal forma que cuando la silicona de viscosidad media se cure, se inmovilice. Encierre los dispositivos cubiertos de elastómero en la caja diseñada. Refuerce la base del implante con acrílico dental. No permita que el acrílico entre en contacto directo con las cintas de la matriz porque la expansión del acrílico mientras se cura puede dañar las trazas conductoras. Aplicar Bupivicaine y baciclina pomada alrededor de la incisión. Cierre la incisión con suturas de nylon 4-0 y pegamento para la piel. 6. Recuperación y cuidado de implantes Retire al animal del instrumento estereotáctico y colóquelo de lado en una almohadilla de calentamiento. Dar inyección subcutánea de la solución cálida de Ringer (5 – 10 mL) para hidratar al animal. Una vez que el animal está locomoting (10 – 60 min), pasar a una jaula con la mitad de la jaula bajo una almohadilla de calentamiento a 37 oC durante 2-3 días. Bajo una almohadilla de calefacción, dar acceso a alimentos y agua ablandados. Inyectar animal con 2 mg/kg de Meloxicam cada 24 h (administración subcutánea u oral) durante 1 semana según sea necesario para el control del dolor. Permita que la rata sane 1-2 semanas y se ajuste al peso del implante(Figura 8B). Realice un lavado regular de clorhexidina del tejido alrededor del implante y una inspección diaria de irritación, infección o dehiscencia. Figura 8: Múltiples matrices insertadas y ratas después de la recuperación de la implantación. (A) Conectores de hardware en ubicaciones para no interferir con las inserciones posteriores. (B) Un implante de matriz de polímerocrónico de 1.024 canales. Reproducido con permiso de Neuron [Figura Suplementaria 1H]1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Representative Results

Siguiendo este protocolo, una grabación de implante neural de 1.024 canales produjo 375 unidades individuales1 (ordenadas con MountainSort50,superposición de ruido 0,96, 512 canales utilizados para la grabación de una sola unidad, Figura 9A). Este protocolo se puede utilizar para implantar diferentes números de dispositivos, con diferentes recuentos de canales y especificaciones, a diferentes combinaciones de objetivos de grabación. Utilizando el mismo protocolo, se ha demostrado una sola unidad de longevidad de grabación durante al menos 160 días1 en datos de 19 dispositivos (18 dispositivos de 32 canales en córticos prefrontales, un dispositivo de 64 canales en corteza orbitofrontal) a través de tres ratas diferentes ( Figura 9B). Uno de los tres animales tuvo un fallo eléctrico digital que resultó en una incapacidad para grabar desde cuatro dispositivos. De los dispositivos 15/19 restantes, hubo un promedio de rendimiento de grabación de 1 unidad individual por canal. Los dispositivos individuales tenían rendimientos de sólo unas pocas unidades individuales de hasta 2 unidades por canal. Es típico ver rendimientos muy diferentes en dispositivos implantados en el mismo animal en la misma región. Además, un equipo quirúrgico diferente siguiendo el protocolo descrito aquí implantó seis animales adicionales cada uno con una combinación de 4-6 dispositivos de 32 canales dirigidos a la corteza orbitofrontal y accumbens nucleus, y un hipermotor de tetrode (implante total aproximadamente 50 g). Un animal se desprendía un implante un mes después de la cirugía. Un segundo animal murió durante el período de recuperación postoperatorio, probablemente no relacionado con los pasos del protocolo descritos aquí. Los cuatro animales restantes permanecieron sanos con implantes estables que durante la duración del experimento, que duró 4-11 meses. Los recuentos de unidades únicas eran similares a los notificados anteriormente para dispositivos de 32 canales. Figura 9: Rendimiento de una sola unidad y longevidad de grabación.(A) Número de clústeres putativos de una sola unidad de 512 canales (del implante de 1.024 canales), estratificados por umbrales métricos de calidad. La curación automatizada con MountainSort (superposición de ruido 0,03, aislamiento 0,96, caja negra en la parte superior derecha) dio lugar a la identificación de 375 unidades individuales de los 512 canales. Reproducido con permiso de Neuron [Figura 2A]1. (B) Rendimiento de una sola unidad para matrices de polímeros por canal (eje Y izquierdo) o por vástago de 16 canales (eje Y derecho) durante 160 días después de la implantación (eje X) en ratas. La línea sólida es el rendimiento medio de la celda a través de 8 vástagos, líneas punteadas a 1 SE. Los puntos de tiempo individuales por vástago se muestran como puntos codificados por color por región. Reproducido con permiso de Neuron [Figura 3A]1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este es un método para la implantación de múltiples matrices de electrodos de polímeros a áreas cerebrales distribuidas para el registro de unidades individuales durante meses. Este método representa un aumento de 8 veces en los canales de grabación y un aumento de 4 veces en el número de inserciones desde el sistema basado en arreglos de polímeros a gran escala más cercano²^,³. Ese sistema utilizaba un sistema basado en la inyección de malla de polímero en el ratón, pero no reportó un número absoluto de unidades únicas putativas y por lo tanto no es posible comparar el rendimiento de una sola neurona.

El método para la inserción de un dispositivo flexible se basa en un protocolo anterior de Felix et al.³⁹, con modificaciones importantes: un aparato de inserción de tres piezas para el movimiento independiente de la lanzadera de silicio durante la retracción, y el tethering de la matriz a su profundidad objetivo antes de la retracción del transbordador, lo que en conjunto elimina la necesidad de la rápida retirada descrita en el protocolo original. Estos cambios minimizan el daño tisular y mantienen la estabilidad de la matriz durante la retracción del trans bordador. Otras estrategias de implantación de dispositivos flexibles, como la endurecimiento temporal de dispositivos con materiales bio disueltos, son compatibles con los pasos posteriores de este protocolo. Asegurar los dispositivos dentro del implante requería integrar estrategias previamente validadas para cubrir el cerebro y proteger las delicadas cintas del dispositivo.

Debido a su fragilidad, se requiere cuidado y atención para evitar el contacto directo o la transmisión de fuerza a las matrices de electrodos de polímero y las lanzaderas de inserción de silicio. Especialmente cuando se trabaja con varios dispositivos, la inserción debe observarse bajo un microscopio para evitar la interferencia de un dispositivo con otro. En general, es posible manejar suavemente una matriz de electrodos con fórceps con puntas de plástico, evitando las trazas. Esta estrategia es apropiada, por ejemplo, si la matriz de electrodos de polímero comienza a retraerse con el transbordador de inserción. Esto puede ocurrir si el PEG no está completamente disuelto, o debido a la tensión superficial de la solución salina o el LSER entre el polímero y el silicio.

Uno de los errores recuperables más comunes es el desprendimiento de matriz de la lanzadera de inserción. Esto puede ocurrir en la inserción, a medida que el cerebro se deshoya y aumenta la presión en la punta del dispositivo, si la matriz y el trans bordador están alineados de forma imperfecta o si la condensación ha disuelto parcialmente el PEG. Para volver a adherir una matriz, elevarla lo más alto posible por encima de la superficie del cerebro y esperar a que se seque (aproximadamente 5 min).

Un aspecto crítico de la planificación de una cirugía de implantación multi-array es el diseño de la pieza base para acomodar todos los objetivos del implante y sentarse sin huecos contra el contorno del cráneo. La pieza base es una pequeña pieza de plástico que se fija al cráneo después de la limpieza del cráneo, la colocación del tornillo y las cranetomías parciales, antes de la inserción de las matrices. Tiene tres funciones: 1) mantener la solución salina para disolver el PEG después de la inserción de la matriz, pero antes de la retracción del transbordador de silicio, 2) para proporcionar una ubicación por encima de la superficie del cráneo a la que las matrices se pueden unir por alas de poliimida, permitiendo así el alivio de la tensión a lo largo de la cinta por encima de su punto de inserción en el cerebro, y 3) para sostener el sellador dural artificial, que estabiliza y protege las matrices y el cerebro. La pieza base se puede confeccionarse a mano o impreso en 3D. Se observó que el drenaje y secado de la pieza base de la salina son muy importantes antes de la inserción del dispositivo. Estos pasos evitan la condensación y la separación de la matriz y el transbordador de inserción. El secado de la pieza base también es fundamental para llenar la pieza base con sellador dural artificial. También es importante que la pieza base no se filtre, ya que una película de gel de silicona es difícil de eliminar del cráneo y evitará la adhesión de acrílico dental para la fijación crónica fiable del implante al cráneo. Se espera que cualquier elastómero de silicona biocompatible de baja viscosidad podría utilizarse para llenar las cranetomías y la pieza base, con un elastómero de silicona de mayor viscosidad que lo rodea y las cintas de matriz de polímeros expuestos.

Los avances en nanofabricación de polímeros se traducirán en matrices de electrodos a base de polímeros, reduciendo el tamaño de las características y aumentando el número posible de electrodos en una matriz más cercana a las de los dispositivos de silicio¹⁵^,^16,¹⁷ ^,¹⁸^,¹⁹. Del mismo modo, las áreas transversales de los dispositivos de polímero se reducirán junto con los tamaños de las características, proporcionando una biocompatibilidad aún mejor^8. Una vez más, como se está logrando con los dispositivos de silicio, la integración con los chips de amplificación, digitalización y multiplexación¹⁷ permitirá aún más la grabación neuronal a mayor escala.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la concesión NINDS U01NS090537 a L.M.F y V.M.T., la subvención NIMH F30MH109292 a J.E.C, y la subvención NIMH F30MH115582 a H.R.J. J.E.C. y H.R.J. también son compatibles con la subvención NIGMS MSTP #T32GM007618. El Instituto Flatiron es una división de la Fundación Simons.

Materials

3D Printed Stereotax Adapter Parts (3) and Base Piece (1)	N/A	N/A	3d print parts, suggest <30 μm resolution for minimal hand finishing of parts. Files available at:
	N/A	N/A	https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3dParts
Dental Acrylic (Hygenic Repair Resin, Coltene type II quick set)	Colten/Whaledent	8886784, 8881627	Dental acrylic for use during implant construction
Hydraulic Micromanipulator (x2)	Narishige Group	MO-10	1-axis micromanipulator
Kapton Polyimide Tape	Bertech	PPTDE-1/2	Double-sided tape
Kopf Stereotax Arm	Kopf Instruments	103088R, 103088L	Standard rodent stereotax
Light Curable Dental Acrylic, Vivid Flow	Coltene/Whaledent	D33-01-00	Light curable dental acrylic for use during implant construction
Loctite Gel Control	Henkel Corp.	234790 1364076 1735574 1752699	Cyanoacrylate for adhering silicon shuttle to corresponding 3d printed part
Metabond Quick Cement	Parkell	S380	For direct application to skull to create strong connection between skull and implant
Polymer Electrode Arrays and Silicon Insertion Shuttles	Lawrence-Livermore National Laboratory	N/A	Fabricated at Lawrence-Livermore National Laboratory, polyimide electrode arrays, silicon insertion shuttle
Silicone Gel Kit, Low Viscosity	Dow Corning	03/80	Low-viscosity silicone gel for filling of 3d printed base piece
Silicone, Medium-Viscosity Kit	World Precision Instruments	Kwik-Sil	Medium-viscosity silicone gel for protection of polymer electrode arrays

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Chung, J. E., Joo, H. R., Smyth, C. N., Fan, J. L., Geaghan-Breiner, C., Liang, H., Liu, D. F., Roumis, D., Chen, S., Lee, K. Y., Pebbles, J. A., Tooker, A. C., Tolosa, V. M., Frank, L. M. Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays. J. Vis. Exp. (152), e59957, doi:10.3791/59957 (2019).

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