Hieronder beschreven is een methode voor implantatie van meerdere polymeer elektrode arrays in anatomisch verre hersengebieden voor chronische elektrofysiologische opname in vrij bewegende ratten. Voorbereiding en chirurgische implantatie worden gedetailleerd beschreven, met de nadruk op ontwerpprincipes om de aanpassing van deze methoden voor gebruik bij andere soorten te begeleiden.
Gelijktijdige opnames van grote populaties van individuele neuronen over gedistribueerde hersengebieden gedurende maanden tot jaren zullen nieuwe mogelijkheden van wetenschappelijke en klinische ontwikkeling mogelijk maken. Het gebruik van flexibele polymeer elektrode arrays kan langdurige opname ondersteunen, maar dezelfde mechanische eigenschappen die zorgen voor een lange levensduur van de opname maken meerdere inserties en integratie in een chronisch implantaat een uitdaging. Hier is een methodologie waarmee meerdere polymeer elektrode arrays kunnen worden gericht op een relatief ruimtelijk onbelemmerd aantal hersengebieden.
De methode maakt gebruik van dun-film polymeer apparaten, geselecteerd voor hun biocompatibiliteit en vermogen om lange termijn en stabiele elektrofysiologisch opname-interfaces te bereiken. Het resulterende implantaat maakt nauwkeurige en flexibele targeting van anatomisch verre gebieden, fysieke stabiliteit voor maanden, en robuustheid aan elektrische ruis. De methodologie ondersteunt maximaal zestien seriële ingevoegde apparaten in acht verschillende anatomische targets. Zoals eerder gedemonstreerd, de methodologie is geschikt voor het opnemen van 1024 kanalen. Van deze, de 512 kanalen in deze demonstratie gebruikt voor single neuron opname leverde 375 enkele eenheden verdeeld over zes opnamelocaties. Belangrijk is dat deze methode ook enkele eenheden voor ten minste 160 dagen kan opnemen.
Deze implantatie strategie, inclusief het tijdelijk bracen van elk apparaat met een inklapbare silicium-plaatsings shuttle, omvat het Tethering van apparaten op hun doel diepten naar een met schedel vastgehouden plastic basisstuk dat op maat is ontworpen voor elke set van opname doelstellingen en stabilisatie/bescherming van de apparaten in een met silicone gevulde, op maat ontworpen plastic behuizing. Ook bedekt is de bereiding van hulpmiddelen voor implantatie, en ontwerpprincipes die aanpassing aan verschillende combinaties van hersengebieden of array ontwerpen moeten begeleiden.
Een ideaal neurale implantaat zou opnemen van een zeer groot aantal individuele neuronen in gedistribueerde hersengebieden gedurende weken tot maanden. Flexibele polymeer elektrode arrays bieden elektrofysiologische opnames met de levensduur om maanden lang op te nemen en de stabiliteit om individuele neuronen te volgen1,2,3. Echter, dezelfde mechanische eigenschappen die vermindering van de afschuiving schade4 en verlenen biocompatibiliteit en opname mogelijkheid2,3,5,6,7, 8 vormen een uitdaging voor hun inbrengen in de hersenen ten opzichte van hun stijve tegenhangers. Vorig werk volbracht een maximum van 4 32-Channel arrays, maar de totale opbrengst van gesorteerde vermoedelijke enkelvoudige neuronen is niet gerapporteerd2,3,9. Omgekeerd, silicium-gebaseerde elektrode arrays zijn gebruikt in hoge dichtheid, multi-regio implantaten, maar deze technologieën niet de mogelijkheid om op te nemen van de pieken van neuronen gedurende maanden (levensduur) of om te volgen van de dezelfde neuronen (stabiliteit) op die tijdschaal, of de dichtheid om op te nemen van honderden afzonderlijke neuronen in meerdere hersengebieden. De hier gepresenteerde methode overkomt het lage aantal inserties in de huidige polymeer-elektrode array-gebaseerde methoden, waardoor middelen worden geboden voor de elektrofysiologisch registratie van grote aantallen individuele neuronen in meerdere anatomisch verre gebieden voor maanden, met de stabiliteit om op te nemen van de dezelfde individuele neuronen over vele dagen.
Er is enige discussie over het belang van het gebruik van een polymeer substraat in plaats van Microwire-of Silicon-based strategieën. Zoals aangetoond door Dhawale et al.10, zijn micro draden inderdaad geschikt voor maandenlange stabiele opnames bij knaagdieren, hoewel de implantaten beperkt waren tot 16 tetrodes in één regio. Het vergroten van de grootte van het verwarmings-implantaat bereikt een relatief hoge bovengrens, met maximaal 1792 geïmplanteerde kanalen bereikt in een niet-menselijke primaat11. De constructie van de verwarmings-arrays is echter onverenigbaar met silicium-nano fabricageprocessen en is daarom extreem tijdrovend, waarbij elk kanaal afzonderlijk tijdens de bouw12,13 handmatig wordt verwerkt. ,14. Als zodanig is het niet duidelijk of deze technologie een orde van grootte verhoging van opnamekanalen zou kunnen ondersteunen.
Huidige silicium-apparaten kunnen honderden of zelfs meer dan duizend elektroden op een enkel monolithische apparaat15,16,17,18,19plaatsen. De nieuwste silicium fabricageprocessen genereren apparaten met kleinere dwarsdoorsnede gebieden, ongeacht het materiaal, wat resulteert in minder gliacellen activering20,21,22,23 ,24 en meer compatibele apparaten. Er is een variabiliteit in rapporten van Silicon probe single-unit opname levensduur, met sommige wat aangeeft dat relatief grote silicium sondes kunnen bieden op lange termijn opname25,26. Met name de nieuwste commercieel verkrijgbare silicium-apparaten17 hebben de lange levensduur om enkele maanden op te nemen en hebben transversale gebieden die zeer vergelijkbaar zijn met de schachten die worden gebruikt in de hier beschreven methode (Jun et al. 201717: 70 μm x 20 μm, hier beschreven apparaten en in Chung et al. 20191: 68 μm – 80 μm x 14 μm). Vanwege het verschil in stabiliteit, deze sonde is niet aangetoond te kunnen opnemen van de dezelfde neuronen gedurende weken. Dit is waarschijnlijk te wijten aan een combinatie van het gebruik van rigide silicium en directe Tethering aan de schedel, waarvan bekend is dat ze micromotion, instabiliteit en gliose veroorzaken bij de array-Brain interface27,28. Om een apparaat te construeren dat met het zenuwweefsel kan bewegen, zijn materialen die zacht zijn5,29 en flexibele7 vereist. Veel beschikbare polymeren (Zie Geddes en Roeder30, fattahi et al.31, en weltman et al.32 voor beoordelingen) hebben de flexibiliteit en stabiliteit van micro draden en zijn ook compatibel met de nano fabricageprocessen, die het mogelijk maken de dichte verpakking van silicium apparaten.
Verschillende neurale implantatie problemen zijn specifiek voor het gebruik van flexibele polymeer elektrode arrays. De eerste van deze is het inbrengen van de array, omdat flexibele arrays niet de stijfheid hebben om te worden gevorderd in de hersenen, zoals Silicon-of Microwire-gebaseerde strategieën. Het merendeel van de plaatsings strategieën voor flexibele apparaten is afhankelijk van een tijdelijke verstijving van het substraat zoals in deze methode wordt gedaan (Zie Weltman et al.32 ter beoordeling). Er zijn vijf opmerkelijke strategieën die geen gebruik maken van een stijve shuttle. Ten eerste zijn er methoden die gebruik maken van materialen die overstappen van rigide naar compliant bij implantatie33,34. Een nadeel van deze strategie is dat het een relatief groot dwarsdoorsnede gebied vereist om de kracht te bereiken die nodig is voor penetratie van hersenweefsel voordat knik wordt gedicteerd door Eulers knik kracht berekening35. Deze toename van het transversale gebied zal een negatieve invloed hebben op de gezondheid van het omringende weefsel20,21,22,23,24. Ten tweede is het gebruik van een afneembare ondersteunende structuur boven de hersenen36, hoewel dit tijdrovende verwijdering of ontbinding van steigers vereist om een minimale niet-ondersteunde lengte (en hoge knik kracht) te behouden. Als alternatief zou de array moeten worden ingevoegd met een langere niet-ondersteunde lengte, waardoor een stijvere array-substraat of een groter cross-sectionele gebied van de array nodig is. Derde is pre-penetratie om een gat te openen voor de flexibele array te worden ingevoegd in daarna35. Dit vereist nauwkeurige heropening of relatief grote pre-penetratie diameter, en elektrode-array stijfheid en dwarsdoorsnede gebied om niet-ondersteunde invoeging mogelijk te maken. Ten vierde is het gebruik van onoplosbaar coatings om het flexibele apparaat te verstijven. Dit verhoogt aanzienlijk het dwarsdoorsnede gebied en acute schade veroorzaakt door inbrengen, zelfs wanneer speciale voorzorgsmaatregelen worden genomen om de scherpe punt van een apparaat te behouden37. Ten vijfde is de injectie van de polymeer array. Deze strategie heeft succes gehad bij het bereiken van implantaten met tot 4 32-CH inserties2, maar vereist het gebruik van een veel groter dwarsdoorsnede gebied voor het inbrengen, een 250 μm-1,5 mm buitendiameter glazen capillaire buis9, waardoor grotere acute schade. In tegenstelling, met behulp van een verwisselbare shuttle, terwijl het toevoegen van cross-sectionele gebied aan de acute inbrengen, maakt het mogelijk om het gebruik van de stijfste mogelijke materialen, en kan daarom de theoretische minimale grootte bij het invoegen van een willekeurig flexibel apparaat. Zo is het inbrengen met behulp van een stijve shuttle momenteel de aantrekkelijkste optie voor het invoegen van flexibele apparaten.
Er zijn twee vereisten voor elke insertie shuttle aanpak: een voldoende stijf substraat en een manier om het flexibele apparaat aan de ondergrond te koppel. Plaatsings shuttle materialen zijn typisch silicium38,39,40,41, roestvrijstaal 8,42, of wolfraam43,44, 45, met stijvere materialen die kleinere dwarsdoorsnede gebieden mogelijk maken. Deze worden meestal aangebracht met behulp van een lijm zoals polyethyleenglycol (PEG)8,38,39,42,43, elektrostatische krachten40, of direct fysieke koppeling45,46. In alle gevallen zijn de uitdagingen de uitlijning en koppeling van de elektrode-array en de plaatsings shuttle vóór het inbrengen en ontkoppelen na het inbrengen. Hieronder vindt u een verfijning van de methode die door Felix et al.39 is geïntroduceerd om de elektrode-array tijdelijk te laten accolades met een silicium-plaatsings shuttle, bevestigd met behulp van Peg, die wordt verwijderd na het inbrengen van de array op de doeldiepte.
Een tweede uitdaging die wordt gepresenteerd door flexibele apparaten binnen een chronisch implantaat is dat van het stabiliseren van het apparaat in de hersenen, terwijl het nog steeds mogelijk is om het apparaat te integreren in een implantaat dat aan de schedel is bevestigd. De hersenen beweegt ten opzichte van de schedel als gevolg van natuurlijke pulsaties, post-traumatische edemateuze veranderingen, impact, en andere oorzaken, en de elektrode-array moet daarom op zijn minst enigszins vrij om te bewegen ten opzichte van waar het is aangebracht op de schedel en het opnemen van hardware. Dit wordt bereikt met behulp van een 3D-gedrukte kunststof basisstuk, op maat ontworpen voor elke set van implantaat doelen, dat heeft meerdere functies: een zoutreservoir tijdens de implantatie, locatie om de polymeer arrays Tether, en behuizing voor silicone gel. De Tethering-locatie boven de Skull and silicone gel werkt samen om een grotere kromtestraal te creëren voor de array en daardoor grotere drukkrachten op de array mogelijk te maken. Dit op zijn beurt zorgt voor beweging van de hersenen ten opzichte van de ankerpunten van de array (schedel) worden vertaald in knikbelasting.
Verdere uitdagingen omvatten de noodzaak om meerdere arrays te huisdieren en bieden voldoende trekontlasting voor het dier om zich vrijelijk te gedragen zonder overdracht van trillingen of Slag krachten naar de elektrode-arrays, wat kan leiden tot bewegingsvrijheid ten opzichte van zenuwweefsel. Aanpassingen aan oplossingen die zijn gebruikt in vergelijkbare toepassingen waarbij de hersenen stabiel moeten zijn ten opzichte van een stijf opnamescherm, hebben deze uitdaging aangepakt. Een kunstmatige durale Sealant siliconen gel (tabel van materialen), die eerder is aangetoond dat ze niet giftig zijn en CSF-lekkage47voorkomen, biedt tegen druk aan de hersenen om uiterlijke zwelling te voorkomen en om de array te stabiliseren op het hersen oppervlak. Een extra beschermingslaag wordt toegevoegd aan het apparaat linten door de middel-viscositeit, chirurgische grade siliconen elastomeer, eerder gedemonstreerd voor gebruik in het afdichten van chronische neurale elektrode implantaten48. Tot slot wordt het met siliconen gebufferde implantaat en de hoofdfase omhuld met 3D-gedrukte stukken die speciaal zijn ontworpen om een laag massa centrum te behouden voor een minimale reductie van de normale mobiliteit van het dier.
Dit protocol begint met een flexibele polymeer microelect rode array die is gemonteerd op een silicium-plaatsings shuttle. Het gaat met de montage van het array-shuttle-apparaat naar de 3D-gedrukte insteek stukken, beschrijft de chirurgische techniek en de bouw stappen van het implantaat die nodig zijn om een dier met succes te implanteren, en is in staat om zestien polymeer multi-elektrode te ondersteunen arrays geïmplanteerd in acht anatomisch verre gebieden in een enkele rat1.
Dit protocol veronderstelt de uitgangsmaterialen van polymeer elektrode arrays die zijn bevestigd door de biooplos bare lijm polyethyleenglycol (PEG) aan een silicium insertion shuttle, zoals weergegeven in Felix et al.39, en ten minste twee onafhankelijk beweegbare invoeging stuks: een waarop de silicium shuttle wordt gelijmd en waarvan de connector van de elektrode-array zal worden nageleefd. Dit protocol maakt ook gebruik van een derde invoegstuk om de twee invoeg stukken veiliger aan een micro manipulator met micron-schaal te bevestigen. Alle bestanden voor 3D-printen zijn te vinden op: https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3DParts
Elke polymeer-elektrode array, die in deze methode wordt gebruikt, bestaat uit twee tot vier opname schachten, een lint dat de elektrische sporen overbrengt, en, aan het einde van het lint, een hardware-connector of een gedrukte printplaat. De elektrode-array en het lint zijn bevestigd bovenop de Silicon shuttle met PEG. Elk lint heeft een 2 cm lange x 1 mm dikke polyimide buis bevestigd aan het lint via UV-uiverbare epoxy, die loodrecht op de lengte van het lint. Elk apparaat (elektrode-array en insertie shuttle) moet worden geladen op de 3D-gedrukte insteek stukken die zullen worden gebruikt om de array in de hersenen te plaatsen en de shuttle op te trekken (Figuur 1). In dit ontwerp verplaatst de hydraulische insteek micromanipulator (groen, tafel van de materialen) de gehele insteek inrichting (stuk 1, stuk 2 en de terugtrek micromanipulator, oranje) naar de beoogde diepte. Zodra de array is losgemaakt van de insteek inrichting en vast, trekt de tweede, retractie micromanipulator (oranje) stuk 1 en de bijgevoegde shuttle onafhankelijk van de rest van de insteek inrichting, waarbij de shuttle wordt verwijderd zonder de array.
Figuur 1: inserter componenten.
A) de delen 1 en 2 worden tijdelijk met een afneembare schroef aan elkaar bevestigd en zullen later op de zuiger van de micro manipulator (oranje) worden vastgezet. B) de array en de insertie shuttle worden aan stuk 1 gehecht en de array-connector is aan stuk 2 bevestigd met dubbelzijdige tape. Stuk 3 verbindt de terugtrekking micromanipulator en de delen 1 en 2 aan de insertie micromanipulator (groen). De insertie micromanipulator is bevestigd aan een stereotactische adapter voor implantatie positionering. Stukken 1-3 worden afgebeeld in hun relatieve afmetingen. Stuk 4 is een stabiliserend stuk voor de juiste uitlijning van de pendeldienst. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Dit is een methode voor de implantatie van meerdere polymeer elektrode arrays naar gedistribueerde hersengebieden voor het opnemen van enkelvoudige eenheden gedurende maanden. Deze methode vertegenwoordigt een 8x toename in opnamekanalen en 4x toename in aantal inserties van het dichtstbijzijnde grootschalige polymeer-array gebaseerd systeem2,3. Dat systeem gebruikte een polymeer mesh injectie-gebaseerd systeem in de muis, maar heeft geen melding van een absoluut aantal putatieve enkelvoudige eenheden en dus een vergelijking van één neuron opbrengst is niet mogelijk.
De methode voor het inbrengen van een flexibel apparaat is gebaseerd op een eerder Protocol van Felix et al.39, met belangrijke wijzigingen: een drie-delige insteek apparaat voor onafhankelijke beweging van de siliconen shuttle tijdens terugtrekking, en tethering van de array op de doeldiepte voorafgaand aan de terugtrekking van de shuttle, die samen de noodzaak voor de snelle terugtrekking beschreven in het oorspronkelijke protocol te elimineren. Deze veranderingen minimaliseren weefselbeschadiging en behouden de stabiliteit van de array tijdens het intrekken van de shuttle. Andere flexibele implantatie strategieën, zoals het tijdelijk verstijving van apparaten met bio-oplosbare materialen, zijn compatibel met de volgende stappen in dit protocol. Het beveiligen van de apparaten binnen het implantaat vereist het integreren van eerder gevalideerde strategieën voor het bedekken van de hersenen en het beschermen van de delicate apparaat linten.
Vanwege hun kwetsbaarheid zijn zorg en aandacht vereist om direct contact te vermijden of anderszins kracht te geven aan de polymeer elektrode arrays en de silicium-insertie shuttles. Met name bij het werken met meerdere apparaten, moet het inbrengen onder een microscoop worden geobserveerd om interferentie van het ene apparaat met de andere te voorkomen. In het algemeen is het mogelijk om een elektrode-array zachtjes met plastic getipt Tang te hanteren, waardoor de sporen worden vermeden. Een dergelijke strategie is geschikt, bijvoorbeeld als de polymeer elektrode-array begint af te trekken met de invoeg shuttle. Dit kan gebeuren als de PEG niet volledig is opgelost, of als gevolg van de oppervlaktespanning van zoutoplossing of CSF tussen het polymeer en silicium.
Een van de meest voorkomende herstelbare fouten is array loslating van de insertie shuttle. Dit kan gebeuren bij het inbrengen, als de hersenen kuiltjes en druk op het apparaat Tip toeneemt, als de array en shuttle zijn onvolkomen uitgelijnd of als condensatie gedeeltelijk de PEG is opgelost. Om een array opnieuw te hechten, Verhoog het zo hoog mogelijk boven het hersen oppervlak en wacht tot het droog is (ongeveer 5 min).
Een kritisch aspect van het plannen van een multi-array implantatie operatie is het ontwerp van het basisstuk om alle implantaat doelen tegemoet te komen en zonder gaten te zitten tegen de contour van de schedel. Het basisstuk is een klein plastic stuk dat is bevestigd aan de schedel na het schoonmaken van de schedel, schroef plaatsing en gedeeltelijke craniectomies, voorafgaand aan het inbrengen van de arrays. Het heeft drie functies: 1) om een zoutoplossing te houden voor het oplossen van de PEG na het inbrengen van de array, maar vóór silicium shuttle terugtrekking, 2) om een locatie boven het schedel oppervlak te bieden waaraan de arrays kunnen worden bevestigd door polyimide vleugels, waardoor trekontlasting mogelijk is langs het lint boven het invoegpunt in de hersenen en 3) om kunstmatige durale Sealant te houden, die de arrays en de hersenen stabiliseert en beschermt. Het basisstuk kan met de hand worden gevormd of met 3D geprint. Er werd opgemerkt dat het aftappen en drogen van het basisstuk van de zoutoplossing zeer belangrijk is voorafgaand aan het inbrengen van het apparaat. Deze stappen voorkomen condensatie en scheiding van de array en insertie shuttle. Drogen van het basisstuk is ook essentieel voor het vullen van het basisstuk met kunstmatige durale Sealant. Het is ook belangrijk dat het basisstuk niet lekt, als een film van silicone gel is moeilijk te verwijderen uit de schedel en voorkomt hechting van tandheelkundige acryl voor betrouwbare chronische bevestiging van het implantaat aan de schedel. Er wordt verwacht dat een biologisch compatibel siliconen elastomeer met lage viscositeit kan worden gebruikt om de craniectomies en het basisstuk te vullen, met een hogere viscositeit silicone elastomeer eromheen en de blootgestelde polymeer array linten.
Vooruitgang in polymeer nano fabricage zal vertalen naar polymeer-gebaseerde elektrode arrays, verminderen van de grootte van de functie en het verhogen van de mogelijke aantal elektroden in een array dichter bij die van silicium-apparaten15,16,17 ,18,19. Evenzo zullen de transversale gebieden van polymeer apparaten krimpen naast de functie groottes, waardoor nog betere biocompatibiliteit8. Nogmaals, zoals wordt bereikt met Silicon-apparaten, zal integratie met het versterken, digitaliseren en multiplexing chips17 verder grootschalige neurale opname mogelijk maken.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door NINDS Grant U01NS090537 aan L. M. F en V.M.T., NIMH Grant F30MH109292 to J. E. C, en NIMH Grant F30MH115582 H.R.J. J.E.C. en H.R.J. worden ook ondersteund door NIGMS MSTP Grant #T32GM007618. Het Flatiron Institute is een divisie van de Simons Foundation.
3D Printed Stereotax Adapter Parts (3) and Base Piece (1) | N/A | N/A | 3d print parts, suggest <30 μm resolution for minimal hand finishing of parts. Files available at: |
https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3dParts | |||
Dental Acrylic (Hygenic Repair Resin, Coltene type II quick set) | Colten/Whaledent | 8886784, 8881627 | Dental acrylic for use during implant construction |
Hydraulic Micromanipulator (x2) | Narishige Group | MO-10 | 1-axis micromanipulator |
Kapton Polyimide Tape | Bertech | PPTDE-1/2 | Double-sided tape |
Kopf Stereotax Arm | Kopf Instruments | 103088R, 103088L | Standard rodent stereotax |
Light Curable Dental Acrylic, Vivid Flow | Coltene/Whaledent | D33-01-00 | Light curable dental acrylic for use during implant construction |
Loctite Gel Control | Henkel Corp. | 234790 1364076 1735574 1752699 | Cyanoacrylate for adhering silicon shuttle to corresponding 3d printed part |
Metabond Quick Cement | Parkell | S380 | For direct application to skull to create strong connection between skull and implant |
Polymer Electrode Arrays and Silicon Insertion Shuttles | Lawrence-Livermore National Laboratory | N/A | Fabricated at Lawrence-Livermore National Laboratory, polyimide electrode arrays, silicon insertion shuttle |
Silicone Gel Kit, Low Viscosity | Dow Corning | 03/80 | Low-viscosity silicone gel for filling of 3d printed base piece |
Silicone, Medium-Viscosity Kit | World Precision Instruments | Kwik-Sil | Medium-viscosity silicone gel for protection of polymer electrode arrays |