多柔性聚合物电极阵列的慢性植入

本手稿中描述的所有动物相关协议均已获得 UCSF 机构动物护理和使用委员会的批准。 1. 制备用于插入的聚合物电极阵列（约30分钟） 将 1 件连接到第 2 件，通过对齐的垂直孔插入螺钉，将件子锁在一起（图 2）。把这两块拿在一个副子上。将双面胶带 （材料表） 连接到第 2 件的顶部.将稳定件 4 连接到第 1 件的末端。它将通过摩擦进行就地进行。 图 2：阵列-穿梭对齐的装配体。（A） 组装件 1、2 和稳定件，以准备插入穿梭附件。（B） 第 1 件和第 2 件用拇指螺钉放在一起。请点击此处查看此图的较大版本。 用手对齐电极阵列，并将插入穿梭与第 1 件的窄端段连接。当探头与第 1 件的纵向轴对齐时，将阵列接头粘附到第 2 件的平面部分的聚酰亚胺双面胶带上。 使用塑料尖钳，仅接触连接到阵列带的聚酰亚胺翼，将插入的穿梭电极阵列装置从 1 号件上提起到稳定片的外部（图 3A）。 在 1 件的末端涂抹少量氰丙烯酸酯（材料表）或其他粘合剂（±10 μL）。太少不会将插入穿梭牢固地粘附到第 1 块，在插入或缩回过程中会面临分离的风险。太多的风险溢出穿梭和坚持阵列本身到片1。 使用塑料倾斜钳，仅接触连接到阵列带的聚酰亚胺翼，将器件与第 1 块的狭窄部分重新对齐，并将插入穿梭（仅插入的穿梭）的方形卡舌固定在胶水上（图 3B）。通过操纵硅穿梭或 PEG 的侧面进行小的对齐调整。避免对色带或刀柄施加过大的力。 图3：阵列穿梭的对齐、附件和灭菌。（A） 插入穿梭电极阵列装置的正确方向，用于将胶水涂在1号件的坞站上。显示双柄阵列穿梭。（B） 聚合物电极阵列和插入穿梭安装在插入件上，带有临时稳定片进行对齐。显示双柄阵列穿梭。（C） 插入装置装在塑料盒中，在灭菌期间提供保护。请点击此处查看此图的较大版本。 用稳定件的两侧钳子施加温和的向下压力，然后将其从组件中取出，而不移动阵列。 从副件上拆下安装的设备组件（第 1 和 2 块、阵列、插入穿梭和阵列连接器），并用双面胶带将其粘附到小塑料盒的底座上，以便通过环氧乙烷进行灭菌（图 3C）。蒸汽灭菌不适用于这些设备。 2. 基件设计 确定所选立体定向目标的颅骨切除尺寸以及头骨螺钉和接地螺钉的位置。颅骨切除尺寸由阵列足迹决定，有几百微米（+300）微米周长，用于放置调整，以避免表面血管。 使用设计软件（例如，CAD），设计基件的足迹，以环绕计划的颅骨，并适合由时间脊和头骨螺钉定义的周长，最大化头骨表面积，将超出基块粘合的水泥可以结合，将植入物粘附在颅骨上。 轮廓的基片的底部表面，以便它可以粘附到头骨没有缝隙，减少感染的机会，防止盐水或硅胶弹性体渗出。 将基件的高度设置为 3-7 mm，高度足以容纳盐水和硅胶弹性体，但足够低，不会妨碍阵列插入时的可见性。注： 基片可以设计垂直柱或类似功能，聚酰亚胺翅膀可以系在颅骨上方的点。不允许附件点妨碍视图。 3D 打印基件（图 4），并在植入前对基件进行消毒。 图4：为植入准备的骷髅。与头骨螺钉，基础丙烯酸层和固定到头骨的基片完成。 3. 头骨的准备（±2小时） 选择 400 g 或更大的大鼠以支持植入物的重量。使用6-12个月大的雄性长埃文斯大鼠。 麻醉老鼠。将动物放入麻醉室。打开 5% 的半电子。 注射腹内剂量的氯胺酮（50毫克/千克）、木兰素（6毫克/千克）和阿托品（0.14毫克/千克）。 在整个过程中，通过验证没有从爪子捏断和呼吸速率保持50-75呼吸/分钟，每20分钟监测麻醉深度。 给老鼠涂眼膏。 把老鼠的头把头去。 将动物放入立体支架。 通过洗涤部位，每个波维多内-碘手术磨砂，然后是无菌盐水，用三个交替的磨砂来准备手术部位。 将 0.2 cc 的 0.5% 利多卡因注射到头皮中。 在头骨的中线做一个下垂切口，将至少3毫米的前体暴露在胸腔前，3毫米后部暴露在羔羊。 用棉签去除渗透。 使用用笛卡尔坐标平面对颅骨进行评分，用立体定向仪器在布雷格玛处归零，标记插入和颅骨切除部位。 钻颅切除部位，留下一层薄薄的骨头，可以用钳子去除。不要暴露杜拉。这允许清洁头骨的骨尘，而不会破坏杜拉。 钻和插入骨螺钉，一次一个，以防止骨尘进入孔。使用慷慨的等子灌溉去除骨尘。对于大约 50 克的植入物，请使用 10-12 个螺钉。钛螺钉允许骨整合49。 推进螺丝的深度，完全穿透头骨，而不会影响大脑。 将至少一个骨螺钉连接到导电导线，以用作电路接地。 完成所有钻孔后，用盐水清洗骨尘的头骨。 用棉签或其他吸水剂擦干头骨，并在螺钉上涂上一层粘合水泥（材料表）（不要对啮齿动物头骨使用釉质蚀刻剂）。这种初步的粘合粘合水泥层将增加植入粘附，并减少后期粘附步骤的人工。 去除每个颅骨切除部位剩余的薄层骨。 使用带有弯曲尖端的 30 号针，同时避免任何血管。切口的长度与插入穿梭的尺寸相匹配。 如果有出血，用温和的盐水滴注手动灌溉，直到出血停止之前不要继续。 如果正在执行多个尿道，使用凝胶泡沫或其他方法保持站点湿润，例如每隔几分钟用体温盐水进行常规灌溉。 用棉签或其他吸水剂再次干燥头骨，为将基块粘附到头骨上准备。 放置无菌基片。如果基件将覆盖 bregma，则将已知距离内的另一个位置标记为代理。 在基片周围涂抹粘合水泥。用盐水填充粘附的基片;在基件和头骨界面之间的界面处用粘合水泥识别并修补任何泄漏（图5）。注：至关重要的是，将基块完全固定在头骨上，以防止人工硬膜密封胶硅胶泄漏，因为这将防止植入物充分粘附到头骨上。动物已经准备好插入数组了。 4. 阵列的串行插入和穿梭的撤回（每个阵列±1小时） 注：此过程应使用不可行的设备进行试验，特别是对于多阵列植入，其中一个设备可能会干扰后续设备的植入。 将件 1 和 2 装载到回缩式微操作器活塞上。将第 1 件的微操作器设置为扩展位置，将第 3 件的微操作器设置为缩回位置。活塞将滑至第 1 件内的端子深度。第 2 件适合第 3 件的顶部，孔对齐。 将第 3 块装载到插入的微型操作器活塞上，并在第 3 件的底面用螺钉固定到位（图 5A，B）。 将 2 和 3 件装入和拧在一起，以便移动插入式微操作器移动整个插入装置（图 5C）。 拆下将 1 和 2 件放在一起的螺钉。第 1 部分独立于第 2 部分移动，以允许从设备中单独收回插入穿梭。 将螺钉插入与活塞轨道垂直的 1 号件的横向孔中，直到螺钉对活塞施加压力。这可确保第 1 件按照缩回活塞移动，如图5D所示。当设备安装在立体定向仪器上时，请务必选择不会妨碍视力的横向孔。 图5：插入器的装配。（A） 将第 3 件安装到微操作器. （B） 将第 1 件和 2 件的附件连接到插入装置上。（C） 插入件，带安装的电极阵列插入穿梭装置。（D） 拇指螺钉固定件 1 和 2 一起拆下。请点击此处查看此图的较大版本。 从颅骨切除术中取出任何凝胶泡沫。使用实型或代理型布雷格玛进行立体定向定位。将设备移动到插入部位时，保持头骨上方至少几厘米的高度。 避免在颅骨或大脑附近长时间使用阵列穿梭装置，以减少在插入之前或插入期间冷凝从插入穿梭中分离阵列的可能性。如果发生这种情况，尝试将阵列穿梭装置提升到大脑和头骨上方，并等待其干燥和重新粘附。 调整植入物坐标以避免表面血管。如在颅切除术和切除期间，避免直接穿透血管。 轻快地插入设备（±25 μm/s），使用立体定向仪器降低，直到设备进入大脑。该设备不会立即穿透大脑。电阻和凹陷的程度取决于目标位置和设备设计（例如，两个与四个刀柄，尖端角度），但凹陷通常不超过 1 mm（图 6）。 图6：阵列穿插。阵列穿梭被推进到大脑，以瞄准深度。显示四柄阵列穿梭。 一旦进入大脑，降低与微操作器，降低速度接近目标深度： 使用立体定向臂以 25 μm/s 开始插入。 当目标深度高出 2 mm 到 1 mm 时，使用微操作器以 10 μm/s 的速度插入。 当目标深度高出 1 mm 到 500 μm 时，使用微操作器缓慢插入到 5 μm/s。 在最后 500 μm 到目标时，进一步缓慢插入到 1-2 μm/s。 可视化设备机翼（水平聚酰亚胺管）和降低过程中的插入点，以避免过早的穿梭阵列分离。 当达到目标深度（图7A）时，通过轻固化丙烯酸或其他粘合剂（如氰丙烯酸（材料表）将聚酰亚胺机翼双边锚定到基片附件部位。如有必要，干燥基片上的机翼或附着点，因为冷凝可以收集在这些表面上，防止粘附。如果可见度或其他空间限制需要，则仅锚定在一个聚酰亚胺翼翼上通常就足够了。 在溶解之前，PEG 将显示为坐在阵列和插入穿梭接口之上的球状质量（图 7A）。在阵列上轻轻滴下体温盐水，使其粘附在穿梭器上，从而溶解 PEG。这需要时间的时间长度取决于所选 PEG 的分子量，并且完全溶解可以通过直接可视化进行验证。当PEG完全溶解阵列的边界时，从穿梭和片1中可以完全分辨出阵列的边界（图7B）。 图7：航天飞机的回缩。（A） 缩回前的机翼系绳。显示双轴阵列和穿梭。（B） PEG 溶解和翼粘附与刀柄特征（圆形，蓝色），允许在回缩期间直观地确认阵列和穿梭成功分离。（C） 插入穿梭后成功插入阵列。（D） 底片与硅胶填充，用于单个双柄阵列插入。使用的低粘度硅胶具有蓝色色调。请点击此处查看此图的较大版本。 使用回缩微操作器，缓慢地拔下插入穿梭。继续盐水灌溉（±1滴/s）到正在缩回的阵列上。使用与目标深度相关距离的插入速度相同的回缩速度： 使用从目标深度到 -500 μm 的 1-2 μm/s 的微操作器缩回。 当 -500 μm 至 -1 mm 时，使用 5 μm/s 的微操作器加快回缩速度。 当 -1 mm 到 -2 mm 时，使用 10 μm/s 的微操作器加快回缩速度。 使用立体定向臂从 -2 mm 向目标向上以 25 μm/s 的速度缩回。 在回缩期间可视化阵列和插入穿梭之间的接口。聚合物阵列将明显与穿梭分离，并在插入穿梭的刀柄之间的半圆形结处缩回时呈半透明（图7B）。 从第 2 块中取出阵列连接器，并移动到不会干扰后续插入的位置。聚合物电极阵列现在位于大脑中，不再连接到立体定向仪器（图7C）。拆下插入穿梭和其他插入硬件。 对于多个插入，重复步骤 4.1-4.9;在插入所有所需数组之前，不要转到下一节。在彼此250μm内插入两个装置是不明智的，因为在应变缓解区域大脑和翅膀之间轻微的弯曲可以延伸到这一点。 5. 植入物结构（±2小时） 最终阵列插入后，使用移液器或棉签从基块中空盐水，小心不要破坏植入的阵列或色带。 用低粘度硅胶弹性体或其他人工硬膜密封剂填充颅骨和基块。允许它固化 （图 7D）通过多次插入，将硬件连接器放置在不干扰的位置（图 8A）。适当定向阵列连接器，并构造植入物，使色带处于最终所需位置。 将阵列、阵列色带和连接器覆盖在中粘度硅弹性体中。特别注意聚合物-连接器接口，因为这种软硬材料界面容易损坏。完全覆盖阵列色带，使中粘硅固化时，它们固定不动。 在设计的情况下将弹性体覆盖的设备包裹在一起。 用牙科丙烯酸强化植入物底座。不要让丙烯酸直接接触阵列带，因为丙烯酸在固化时膨胀会损害导电痕迹。 在切口周围涂抹布皮维卡因和百利他卡辛药膏。 使用 4-0 尼龙缝合线和皮肤胶关闭切口。 6. 恢复和植入护理 将动物从立体定向仪器中取出，放在加热垫上。 给皮下注射温暖的环林格溶液（5~10 mL）以滋润动物。 一旦动物处于活动位置（10~60分钟），在37°C下将一半的笼子转移到笼子里，为期2-3天。 在加热垫下，提供软化的食物和水。 根据需要，每24小时注射2毫克/千克Meloxicam（皮下或口服）1周。 让大鼠1-2周愈合并调整到植入体的重量（图8B）。 定期对植入物周围的组织进行氯西丁洗涤，并每日检查刺激、感染或脱液。 图8：植入后多个插入的阵列和大鼠。（A） 硬件连接器的位置，不会干扰后续的插入。（B） 1，024通道慢性聚合物阵列植入物。经神经元 [补充图 1H]1许可转载。请点击此处查看此图的较大版本。