Rivelare la raccolta di hemolymph e l'inoculo di Metarhizium blastospores in Rhipicephalus MicroPlus zecche verso gli studi di patologia degli invertebrati
Summary
L’analisi di tick emolinfa rappresenta un’importante fonte di informazioni su come alcuni patogeni causano malattie e come le zecche rispondono immunologicamente a questa infezione. Il presente studio dimostra come inoculare propagule fungine e raccogliere emolinfa da Rhipicephalus MicroPlus femmine gonfio.
Abstract
Le zecche sono ectoparassiti ematophagous obbligate e Rhipicephalus MicroPlus ha grande importanza nella medicina veterinaria perché provoca anemia, perdita di peso, deprezzamento della pelle degli animali e può anche fungere da vettore di diversi agenti patogeni. A causa dei costi esorbitanti per controllare questi parassiti, danni all’ambiente causati dall’uso improprio di acaricidi chimici, e la maggiore resistenza contro i parassiticidi tradizionali, il controllo alternativo delle zecche, con l’uso di funghi entomopatogeni, ad esempio, è stato considerato un approccio interessante. Tuttavia, pochi studi hanno dimostrato come il sistema immunitario del tick agisce per combattere questi entomopatogeni. Pertanto, questo protocollo dimostra due metodi utilizzati per l’inoculo entomopatogeno in femmine gonfio e due tecniche utilizzate per la raccolta di emolinfa e emociti raccolta. L’inoculo degli agenti patogeni all’inserimento delle gambe nel corpo della femmina di zecca consente la valutazione dei parametri biologici delle femmine a differenza dell’inoculo tra lo scutum e il capitulum, che danneggia frequentemente l’organo di Gené. La collezione di emolinfa dorsali ha prodotto un recupero di volume superiore rispetto alla raccolta attraverso le gambe. Alcune limitazioni di tick emolinfa raccolta ed elaborazione includono i) alti tassi di perturbazione degli emociti, II) contaminazione emolitiche con midgut interrotto, e III) recupero di volume di emolymph basso. Quando l’emolitia viene raccolta attraverso il taglio delle gambe, l’emolitico richiede tempo per accumularsi all’apertura della gamba, favorendo il processo di coagulazione. Inoltre, un minor numero di emociti si ottiene nella raccolta attraverso la gamba rispetto alla raccolta dorsale, anche se il primo metodo è considerato più facile da eseguire. Comprendere la risposta immunitaria nelle zecche mediate da agenti entomopatogeni aiuta a svelare la loro patogenesi e a sviluppare nuovi bersagli per il controllo delle zecche. I processi di inoculo qui descritti richiedono risorse tecnologiche molto basse e possono essere utilizzati non solo per esporre le zecche a microrganismi patogeni. Analogamente, la raccolta di tick emolinfa può rappresentare il primo passo per molti studi fisiologici.
Introduction
La zecca del bestiame, Rhipicephalus MicroPlus, è un ematofago ectoparassite con un enorme impatto negativo sul bestiame nelle zone tropicali. Questo tick è il vettore di agenti patogeni come Babesia bovis, Babesia bigemina, e Anaplasma marginale che, combinato con il danno emofeeding diretto, può ridurre il latte e la produzione di carne, causare anemia e, infine, la morte. Le perdite causate da questo ectoparassite sono state stimate in 3,24 miliardi dollari all’anno in Brasile1. Sono richiesti metodi sostenibili e l’uso di agenti entomopatogeni è considerato un’alternativa promettente per ridurre l’uso di acaricidi chimici2,3,4.
I funghi entomopatogeni, come il Metarhizium spp., sono nemici naturali di artropodi tra cui zecche, e alcuni isolati possono essere utilizzati come biocontrollori. Questi patogeni infettano attivamente l’ospite attraverso la cuticola e colonizzano il loro corpo2,5,6. Come si sviluppa l’infezione, risposte cellulari e umorali sono mediate dal sistema immunitario tick. L’analisi del tick emolinfa è segnalata come uno strumento utile per valutare le risposte immunitarie dopo la sfida con i patogeni7,8.
La risposta immunitaria degli artropodi è divisa in risposte umorali e cellulari. La risposta umorale coinvolge i processi di emoagglutinazione e la produzione di proteine/peptidi antimicrobici, mentre la risposta immunitaria cellulare viene eseguita attraverso gli emociti. Queste cellule sono presenti nell’emolymph da tutti gli artropodi e sono segnalate per sviluppare un ruolo espressivo in studi che coinvolgono la risposta immunitaria innata9, in quanto è direttamente correlata alla fagocitosi e processi di incapsulamento. Di conseguenza, gli studi sugli emociti possono aiutare a indagare sulla via della morte e comprendere i processi come l’autofagia, l’apoptosi e la necrosi. In alcuni invertebrati come bivalvi, la raccolta degli emociti affronta limitazioni come la rottura delle cellule, il volume di emolymph basso ottenuto e la bassa concentrazione di cellule recuperate10. Molto frequentemente, a seconda della metodologia applicata, si ottiene una riduzione della concentrazione delle cellule, influenzando direttamente la quantificazione e l’analisi delle cellule.
Il numero di emociti circolanti nell’emolymph è variabile tra diversi artropodi e può cambiare nella stessa specie a causa di diversi stadi fisiologici come il sesso, l’età e la fase evolutiva dell’artropodi11. Gli emociti possono anche essere trovati aderiti ad alcuni organi ed essere rilasciati in circolazione subito dopo il processo di infezione11. Tuttavia, la maggior parte degli studi segnalati usano insetti, mentre le zecche rimangono meno esplorate per quanto riguarda la loro fisiologia e patologia. Nonostante l’inoculo patogeno e la raccolta di emolinfa nelle zecche sono tecniche meno utilizzate, stabilire metodi standard aiuta lo sviluppo di studi più accurati.
Lo scopo del presente studio è stato quello di confrontare i metodi più utilizzati per la raccolta di emolimph e l’inoculo di agenti patogeni nelle zecche R. MicroPlus , valutando l’efficacia nell’acquisizione di emolitiche e nella concentrazione di emociti.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’inoculo dei patogeni è utile quando lo studio mira a indagare l’azione in vivo dei microrganismi nei modelli sperimentali di artropodi perché assicura che l’agente patogeno sia all’interno dell’ospite. La tecnica può essere applicata anche a molecole inoculare come l’interferenza dell’RNA (RNAi). L’inoculo tra lo scutum e il Capitulum è considerato più facile da eseguire ma spesso danneggia l’organo di Gené, compromettendo la vitalità delle uova12,13. Or…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato in parte dal Coordenacão de aperfeiçoamento de pessoal de nível Superior (CAPES) dal Brasile, finanza Codice 001. CAPES ha fornito il dottorato di studio per A.F. Marciano. Ringraziamo il Consiglio nazionale per lo sviluppo scientifico e tecnologico (CNPq) del Brasile per aver fornito il dottorato di ricerca per J. Fiorotti. Questa ricerca è stata sostenuta anche da sovvenzioni della Fondazione Carlos Chagas Filho per la ricerca dello stato di Rio de Janeiro (FAPERJ) e CNPq. V.R.E.P. Bittencourt è un ricercatore CNPq.
Materials
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Schrank, A., Vainstein, M. H. Metarhizium anisopliae enzymes and toxins. Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).
- Camargo, M. G., et al. Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions. Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).
- Perinotto, W. M. S., et al. In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus. Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).
- Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4 (3), 357-374 (2013).
- Angelo, I. C., et al. Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi. Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).
- De Paulo, J. F., et al. Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection. Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).
- Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. Regulators and signalling in insect haemocyte immunity. Cell Signal. 21, 186-195 (2009).
- Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves. Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).
- Nation, J. L. . Insect Physiology and Biochemistry. , (2016).
- Gene, J. Mémoires de l’Académie royale des sciences. Torino. 9, 751 (1848).
- Lees, A. D., Beament, J. W. L. An organ waxing in ticks. The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).
- Sonenshine, D. E., Roe, R. M. . Biology of ticks. , (2014).
- Tan, J., et al. Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori. Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).
- Bowden, T. J. The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus). Fish Research. 186, 367-371 (2017).
- Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks. Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).
- Tsakas, S., Marmaras, V. Insect immunity and its signaling: an overview. Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).
- Burgdorfer, W. Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).
- Patton, T. G., et al. Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).
