Hemolymph toplama ve Metarhizyum blastosporların omurgasız patoloji çalışmalarına doğru Rhipicephalus Microplus ticks içine inoculation
Summary
Kene hemolymph analizi, bazı patojenlerin hastalığa neden olduğu ve keneler immünolojik olarak bu enfeksiyona nasıl yanıt vereceği konusunda önemli bir bilgi kaynağını temsil eder. Bu çalışmada, mantar propagülleri aşılamak ve Rhipicephalus Microplus tıkanmış kadınlarda hemolymph toplamak gösterilmiştir.
Abstract
Keneler, hematofajöz Ektoparazitleri ve Rhipicephalus mikroplus , anemi, kilo kaybı, hayvanların deri amortismanı ve aynı zamanda çeşitli patojenlerin bir vektör olarak hareket edebilir çünkü veteriner tıbbında büyük önem taşımaktadır. Bu parazitler kontrol etmek için fahis maliyetleri nedeniyle, kimyasal akaritelerin uygunsuz kullanımı nedeniyle çevreye zarar, ve geleneksel parazit karşı artan direnç, keneler alternatif kontrol, kullanımı ile Örneğin entomopatogenik mantar, ilginç bir yaklaşım olarak kabul edilmiştir. Yine de, birkaç çalışmada Tick bağışıklık sistemi bu entomopathogens mücadele nasıl davranır göstermiştir. Bu nedenle, bu protokol Entomopatojen aşı için kullanılan iki yöntem gösterilmiştir dişi ve iki teknikleri hemolymph toplama ve hemanosit hasat için kullanılır. Kene dişi vücudunda bacak eklemesinde patojenlerin aşı dişi biyolojik parametrelerin değerlendirilmesine izin verir, skutum ve başkentin arasındaki aşı, hangi sıklıkla Gené organı zarar. Dorsal hemolymph koleksiyonu bacaklardan koleksiyonundan daha yüksek hacimli iyileşme sağladı. Kene hemolymph toplama ve işleme bazı sınırlamalar dahil i) yüksek oranları hemanosit ‘ bozulma, ii) bozmuş midgut ile hemolymph kontaminasyonu, ve iii) düşük hemolymph ses kurtarma. Hemolymph bacak kesme yoluyla toplandığında, hemolymph bacak açılışında birikmesi için zaman alır, pıhtılaşma sürecini tercih. Buna ek olarak, ilk yöntemin gerçekleştirilmesi daha kolay kabul edilse bile, dorsal koleksiyona kıyasla bacak aracılığıyla koleksiyonda daha az hemanosit elde edilir. Entomopatogenik ajanlar tarafından aracılık edilen kenlerde bağışıklık tepkisini anlamak, patogenezini ortaya çıkarmak ve kene kontrolü için yeni hedefler geliştirmek için yardımcı olur. Burada açıklanan aşı süreçleri çok düşük teknolojik kaynaklar gerektirir ve sadece keneler patojen mikroorganizmalara maruz bırakmak için kullanılabilir. Benzer şekilde, kene hemolymph koleksiyonu birçok fizyolojik çalışmalar için ilk adımı gösterebilir.
Introduction
Sığır kene, Rhipicephalus Microplus, tropikal alanlarda Hayvancılık üzerinde büyük bir olumsuz etkisi olan bir hematofagus antiparazitik olduğunu. Bu kene, Babesia Bovis, Babesia bigeminave anaplasma obtus gibi patojenik ajanların vektörü olup, doğrudan hemofeeding hasar ile birlikte, süt ve et üretimini azaltabilir, anemi ve sonuçta ölüm neden olabilir. Bu ektoparasitin neden olduğu kayıplar Brezilya ‘da yıllık 3.240.000.000 dolar olarak tahmin edildi1. Sürdürülebilir Yöntemler talep edilir ve entomopatogenik ajanların kullanımı, kimyasal akarisitlerin kullanımını azaltmak için umut verici bir alternatif olarak kabul edilir2,3,4.
Metarhizyum spp. gibi entomopati ojenik mantarlar, keneler de dahil olmak üzere eklemropodların doğal düşmanlarıdır ve bazı izolatlar biyodenetleyici olarak kullanılabilir. Bu patojenler aktif olarak manikür yoluyla ev sahibi enfekte ve vücudunu kolonize2,5,6. Enfeksiyon geliştikçe, hücresel ve humoral tepkiler kene bağışıklık sistemi tarafından aracılık edilir. Kene hemolymph Analizi patojenler ile zorlu sonra bağışıklık yanıtlarını değerlendirmek için yararlı bir araç olarak bildirilen7,8.
Arthropods ‘ bağışıklık tepkisi humoral ve hücresel tepkiler ayrılmıştır. Humoral yanıt hemaglütinasyon süreçleri ve antimikrobiyal proteinler/peptidler üretimi içerir, hücresel bağışıklık yanıtı hemanositler aracılığıyla gerçekleştirilir ise. Bu hücreler tüm eklemropodlar hemolymph mevcut ve doğal bağışıklık tepkisi içeren çalışmalarda ifade rol geliştirmek için bildirilen9, doğrudan fagositoz ve kapsülleme süreçleri ile ilgili olduğu gibi. Buna göre, hemanositler hakkında çalışmalar ölüm yolunun araştırılması ve otophagy, apoptozis ve nekroz gibi süreçleri anlamanıza yardımcı olabilir. Bazı omurgasızlar olarak biyvalfler, hemanosit koleksiyonu hücre bozulması gibi sınırlamalar, düşük hemolymph hacmi elde, ve düşük konsantrasyon kurtarılmış hücreler10. Çok sık, uygulanan metodolojiye bağlı olarak, hücrelerin miktarlama ve analizini doğrudan etkileyen, azaltılmış hücre konsantrasyonu elde edilir.
Hemolymph içinde dolaşan hemanosit sayısı farklı eklemropodlar arasında değişkendir ve seks, yaş ve Artropod ‘un gelişimsel aşaması11gibi farklı fizyolojik aşamalar nedeniyle aynı türde değişebilir. Hemanositler de bazı organlara yapışmış bulunabilir ve enfeksiyon işleminden hemen sonra dolaşım içine salınabilir11. Yine de, çoğu çalışmada böcek kullanımı bildirilmiştir, keneler ise fizyolojisi ve patolojileri ile ilgili daha az incelenmiştir. Patojen inokülasyon ve hemolymph koleksiyonuna rağmen keneler daha az kullanılan tekniklerdir, standart yöntemler kurulması daha doğru çalışmaların gelişmesine yardımcı olur.
Bu çalışmanın amacı, hemolymph toplama ve patojenlerin inokülasyon için en çok kullanılan metotlarını R. Microplus Ticks olarak karşılaştırmaya, hematositlerin elde edilmesi ve hemanosit konsantrasyonunda etkinliğini değerlendirmek idi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Patojenlerin inoculation çalışması, çalışmada deneysel Artropod modellerinde mikroorganizmaların in vivo eylemini araştırmayı amaçladığından, çünkü patojenin ev sahibinin içinde olduğunu garanti eder. Bu teknik Ayrıca RNA parazitleri (RNAi) gibi aşılamak moleküllere de uygulanabilir. Scutum ve başkentlik arasında inoculation gerçekleştirmek için daha kolay kabul edilir ama sık zarar Gené organı, yumurtalarını zayıflatır12,13. G…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada Brezilya ‘dan Coordenacão de Aperfeiçoamento de pessoal de nível Superior (CAPES), Finance Code 001 tarafından finanse edilmiştir. CAPES A.F. Marciano için Doktora Bursu sağladı. Biz J. Fiorotti için Doktora Bursu sağlamak için Brezilya bilimsel ve Teknolojik Kalkınma (CNPq) Ulusal Konseyi teşekkür ederiz. Bu araştırma aynı zamanda Rio de Janeiro (FAPERJ) ve CNPq devlet araştırma Carlos Chagas Filho Vakfı Hibe tarafından desteklenmektedir. V.R.E.P. Bittencourt bir CNPq araştırmacıdır.
Materials
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Schrank, A., Vainstein, M. H. Metarhizium anisopliae enzymes and toxins. Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).
- Camargo, M. G., et al. Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions. Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).
- Perinotto, W. M. S., et al. In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus. Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).
- Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4 (3), 357-374 (2013).
- Angelo, I. C., et al. Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi. Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).
- De Paulo, J. F., et al. Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection. Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).
- Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. Regulators and signalling in insect haemocyte immunity. Cell Signal. 21, 186-195 (2009).
- Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves. Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).
- Nation, J. L. . Insect Physiology and Biochemistry. , (2016).
- Gene, J. Mémoires de l’Académie royale des sciences. Torino. 9, 751 (1848).
- Lees, A. D., Beament, J. W. L. An organ waxing in ticks. The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).
- Sonenshine, D. E., Roe, R. M. . Biology of ticks. , (2014).
- Tan, J., et al. Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori. Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).
- Bowden, T. J. The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus). Fish Research. 186, 367-371 (2017).
- Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks. Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).
- Tsakas, S., Marmaras, V. Insect immunity and its signaling: an overview. Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).
- Burgdorfer, W. Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).
- Patton, T. G., et al. Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).
