Divulgando a coleta de Hemolinfas e a inoculação de blastósporos de Metarhizium em carrapatos de Rhipicephalus MICROPLUS para estudos de patologia de invertebrados
Summary
A análise da hemolinfa de carrapato representa uma importante fonte de informações sobre como alguns patógenos causam doenças e como os carrapatos respondem imunologicamente a essa infecção. O presente estudo demonstra como inocular propágulos fúngicos e coletar hemolinfas de fêmeas de Rhipicephalus MICROPLUS ingurgizadas.
Abstract
Carrapatos são obrigatórios ectoparasitas hematófagos e Rhipicephalus MICROPLUS tem grande importância na medicina veterinária porque causa anemia, perda de peso, depreciação do couro dos animais e também pode atuar como um vetor de vários patógenos. Devido aos custos exorbitantes para controlar esses parasitas, danos ao meio ambiente causados pelo uso inadequado de acaricidas químicos, e o aumento da resistência contra parasiticidas tradicionais, controle alternativo de carrapatos, pelo uso de os fungos entomopatogénicos, por exemplo, foram considerados uma aproximação interessante. No entanto, poucos estudos demonstraram como o sistema imunológico do carrapato atua para combater esses entomopatógenos. Portanto, este protocolo demonstra dois métodos utilizados para a inoculação de entomopatógenos em fêmeas ingurgedadas e duas técnicas utilizadas para coleta de hemolinfas e hemócitos. A inoculação de patógenos na inserção da perna no corpo da fêmea do carrapato permite a avaliação de parâmetros biológicos femininos diferentemente da inoculação entre o Scutum e o capitulo, que freqüentemente danifica o órgão de Gené. A coleção dorsal do hemolinfa rendeu uma recuperação mais elevada do volume do que a coleção através das pernas. Algumas limitações da coleta e processamento de hemolinfas de carrapato incluem i) altas taxas de ruptura de hemócitos, II) contaminação da hemolinfa com intestino médio interrompido e III) baixa recuperação do volume da hemolinfa. Quando a hemolinfa é coletada através do corte da perna, a hemolinfa leva tempo para se acumular na abertura da perna, favorecendo o processo de coagulação. Além disso, menos hemócitos são obtidos na coleta através da perna em comparação com a coleta dorsal, embora o primeiro método seja considerado mais fácil de ser realizado. Compreender a resposta imune em carrapatos mediados por agentes entomopatogênicos ajuda a revelar sua patogênese e desenvolver novos alvos para o controle do carrapato. Os processos de inoculação aqui descritos requerem recursos tecnológicos muito baixos e podem ser utilizados não apenas para expor carrapatos a microrganismos patogênicos. Da mesma forma, a coleta de hemolinfa de carrapato pode representar o primeiro passo para muitos estudos fisiológicos.
Introduction
O carrapato de bovinos, Rhipicephalus MICROPLUS, é um ectoparasita hematófago com um enorme impacto negativo sobre o gado em áreas tropicais. Este carrapato é o vetor de agentes patogénicos, como Babesia bovis, Babesia bigemina, e Anaplasma marginale que, combinada com o dano de hemofeeding direto, pode reduzir a produção de leite e carne, causar anemia e, finalmente, a morte. As perdas causadas por este ectoparasita foram estimadas em 3.240.000.000 dólares anuais no Brasil1. São exigidos métodos sustentáveis e a utilização de agentes entomopatogênicos é considerada uma alternativa promissora para reduzir o uso de acaricidas químicas2,3,4.
Fungos entomopatogênicos, como Metarhizium spp., são inimigos naturais de artrópodes, incluindo carrapatos, e alguns isolados podem ser usados como biocontroladores. Esses patógenos infectam ativamente o hospedeiro através da cutícula e colonizam ocorpo2,5,6. À medida que a infecção se desenvolve, as respostas celulares e humorais são mediadas pelo sistema imunológico do carrapato. A análise da hemolinfa do carrapato é relatada como uma ferramenta útil para avaliar as respostas imunes após o desafio com os patógenos7,8.
A resposta imune dos artrópodes é dividida em respostas humorais e celulares. A resposta humoral envolve processos de hemaglutinação e produção de proteínas/peptídeos antimicrobianos, enquanto a resposta imune celular é realizada através dos hemócitos. Estas células estão presentes na hemolinfa de todos os artrópodes e são relatadas para desenvolver um papel expressivo em estudos envolvendo a resposta imune inata9, pois está diretamente relacionado com os processos de fagocitose e encapsulação. Assim, estudos sobre hemócitos podem ajudar a investigar a via de morte e compreender processos como autofagia, apoptose e necrose. Em alguns invertebrados como bivalves, a coleção de hemócitos enfrenta limitações como ruptura celular, baixo volume de hemolinfa obtido e baixa concentração de células recuperadas10. Muito freqüentemente, dependendo da metodologia aplicada, a concentração reduzida de células é obtida, impactando diretamente na quantificação e análise das células.
O número de hemócitos circulantes na hemolinfa é variável entre os diferentes artrópodes e pode mudar na mesma espécie devido a diferentes estágios fisiológicos, como sexo, idade e estágio de desenvolvimento do artrópode11. Hemócitos também podem ser encontrados aderiram a alguns órgãos e ser liberado em circulação logo após o processo de infecção11. No entanto, a maioria dos estudos relatou uso de insetos, enquanto os carrapatos permanecem menos explorados quanto à sua fisiologia e patologia. Apesar da inoculação do patógeno e da coleta de hemolinfas em carrapatos são técnicas menos utilizadas, o estabelecimento de métodos padrão auxilia no desenvolvimento de estudos mais precisos.
O objetivo do presente estudo foi comparar os métodos mais utilizados para coleta de hemolinfas e inoculação de patógenos em carrapatos de R. MICROPLUS , avaliando a eficácia na concentração de hemolinfas e hemócitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A inoculação de patógenos é útil quando o estudo objetiva investigar a ação in vivo de microrganismos em modelos experimentais de artrópodes, pois assegura que o patógeno está dentro do hospedeiro. A técnica também pode ser aplicada para inocular moléculas como a interferência do RNA (RNAi). A inoculação entre o Scutum e o capitulo é considerada mais fácil de realizar, mas freqüentemente danifica o órgão de Gené, prejudicando a viabilidade dos ovos12,13<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi financiado em parte pela coordenacão de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES) do Brasil, código financeiro 001. CAPES forneceu bolsa de doutorado para AF marciano. Agradecemos ao Conselho Nacional de desenvolvimento científico e tecnológico (CNPq) do Brasil pela prestação de bolsa de doutorado para J. Fiorotti. Esta pesquisa também foi apoiada por subsídios da Fundação Carlos Chagas filho para a pesquisa do estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e do CNPq. V.R.E.P. Bittencourt é pesquisador do CNPq.
Materials
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
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