العلاج العابر للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى مع DMSO لتعزيز التمايز
Summary
توليد أنواع الخلايا المتمايزة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى (hPSCs) يحمل وعدا علاجيا كبيرا ولكن لا يزال تحديا. وكثيراً ما تظهر المراكز الخاصة بهذه المراكز عجزاً متأصلاً عن التمييز حتى عندما يتم تحفيزها بمجموعة مناسبة من الإشارات. يوصف هنا هو أداة بسيطة لتعزيز التمايز متعدد السلالات عبر مجموعة متنوعة من خطوط PSC.
Abstract
وعلى الرغم من الاستخدام المتزايد للخلايا الجذعية المتعددة القوى، لا تزال هناك تحديات في التمييز الفعال بين الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة المتعددة القوى (ESCs وiPSCs) عبر مختلف السلالات. وقد وُضعت بروتوكولات تمايز عديدة، ومع ذلك فإن التباين بين الخطوط الخلوية وانخفاض معدلات التمايز يضفيان تحديات في تنفيذ هذه البروتوكولات بنجاح. ويوصف هنا بأنه وسيلة سهلة وغير مكلفة لتعزيز قدرة الشركات الخاصة على التمايز. وقد تبين من قبل أن معالجة الخلايا الجذعية ذات التركيز المنخفض من كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO) يزيد إلى حد كبير من ميل مجموعة متنوعة من الشركات الخاصة إلى التفريق إلى أنواع مختلفة من الخلايا بعد التمايز الموجه. وقد ثبت الآن أن هذه التقنية فعالة عبر أنواع مختلفة (على سبيل المثال، الماوس، الرئيسيات، والإنسان) في سلالات متعددة، بدءا من الخلايا العصبية وspheroids القشرية إلى خلايا العضلات الملساء وخلايا الكبد. يعمل العلاج المسبق لـ DMSO على تحسين تمايز PSC من خلال تنظيم دورة الخلايا والخلايا الجذعية فتيلة لتكون أكثر استجابة لإشارات التمايز. وترد هنا المنهجية التفصيلية لاستخدام هذه الأداة البسيطة كوسيلة قابلة للاستنساخ وقابلة للتطبيق على نطاق واسع للتمييز بكفاءة أكبر بين الشركات الخاصة وأي سلالة من الاختيار.
Introduction
وقد أدى استخدام الخلايا الجذعية متعددة القوى إلى العديد من التطورات في البحوث الطبية الحيوية، بما في ذلك مجالات الطب التجديدي والعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية، ونمذجة الأمراض، وفحص الأدوية. كما أدى ذلك إلى الآفاق العامة لمزيد من البحوث القابلة للترجمة والطب الشخصي. وقد سمح ظهور تكنولوجيا الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSC) منذ أكثر من 20 عاماً للباحثين بتطوير خلايا جذعية متعددة القوى من الأنسجة الجسدية وتمييزها إلى أنواع الخلايا الوظيفية لدراسة مجموعة متنوعة من الأمراض، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية والعصبية والمناعية. على الرغم من أن خطوات كبيرة قد قطعت في تكنولوجيا تمايز الخلايا الجذعية، لا تزال التحديات في التمييز الفعال بين الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وiPSCs مستمرة، مما يحد من الاستخدام الواسع النطاق لتكنولوجيا الخلايا الجذعية عبر مختلف برامج البحوث. لا يزال التباين المتأصل عبر خطوط الخلايا المختلفة والحيوانات المستنسخة يشكل عقبات أمام التمييز بين خطوط الخلايا الجذعية إلى اللاينات المطلوبة1. وعلاوة على ذلك، فإن اشتقاق خلايا وظيفية ناضجة ومختلفة بشكل نهائي عن هذه المراكز لا يزال عملية شاقة وغير فعالة عبر العديد من السلالات. في الواقع، الخلايا المتمايزة عن hPSCs غالبا ً ما تفشل في التمييز بشكل نهائي في الخلايا الوظيفية2. في مزيد من نقل العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية لاستخدامها في المرضى، هناك حاجة إلى تحسين وضمان فعالية الخلايا التي يتم إنشاؤها من hPSCs.
وقد أنشأ مختبرنا أداة سريعة وغير مكلفة لتعزيز كفاءة التمييز بين كل من iPSCs وESCs في أنواع الخلايا الناضجة. وجدنا أن المعالجة المسبقة للhiPSCs وhESCs مع كبريتيد ثنائي الميثيل الكاشف شائع الاستخدام (DMSO) لمدة 24 ساعة إلى 48 ساعة قبل توجيه التمايز يؤدي إلى تحسن ملحوظ في قدرة تمايز الخلايا الجذعية. العلاج مع DMSO يزيد من نسبة hiPSCs وhESCs في مرحلة G1 المبكرة من دورة الخلية وينشط بروتين الريتينوبلاستوما (Rb)3، وهو منظم حاسم لانتشار الخلايا، والبقاء على قيد الحياة، والتمايز4. في العمل الأحدث، تم العثور على أن Rb وأفراد أسرته مطلوبة للآثار المؤيدة للتمايز من DMSO، بحيث التعطيل العابر للRb يمنع آثار DMSO، في حين أن التنشيط التأسيسي للRb بطريقة عابرة يعزز آثار DMSO5. مماثلة لدورة الخلية أثناء النمو الجنيني، تتميز دورة الخلايا من ESCs وiPSCs بمرحلة G1 مختصرة التي تشجع على التجديد الذاتي6،7،8. هذه المرحلة المختصرة G1 تسمح بانتشار أكثر غير مقيد ة ولكنها تحد من إمكانية التمايز4و9. من خلال تعزيز القبض على النمو في G1 وتفعيل ضوابط نقاط التفتيش في دورة الخلايا من hESCs وiPSCs، والعلاج DMSO رئيس الخلايا للتغيرات مصير الخلية بعد التمايز الموجه.
حتى الآن، وقد ثبت DMSO المعالجة المسبقة لتحسين القدرة على التمايز لجميع الطبقات الجرثوميةالثلاث في أكثر من 30 السيطرة والأمراض الخاصة بالإنسان ESC وiPSC خطوط الخلايا 3،5، فضلا عن التمايز من الخلايا الجذعية وغيرها خطوط الخلايا إلى مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا الناضجة الأخرى في الدراسات اللاحقة10،11،12،13،14،15،16، 17 سنة , 18 سنة , 19 سنة , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 (الجدول1). وعلاوة على ذلك، تبين أن علاج DMSO فعال في تعزيز التمييز بين الخلايا الأولية غير البشرية21و23 (مثل الماوس والرئيسيات والأرانب)، مما يشير إلى آليات مشتركة عبر الأنواع. وأخيراً، تم توسيع نطاق المعالجة المسبقة لـ DMSO لتشمل تكنولوجيا تحرير الجينات، حيث أظهرت دراسة خاصة أن المعالجة المسبقة لـ DMSO 24 ساعة من الـ HESCs/iPSCs زادت بشكل كبير من قدرة عمليات التكرار القصيرة المتداخلة المتباعدة (CRISPR) /CRISPR المرتبطة البروتين-9 (Cas9) بوساطة كفاءة التحرير من الحمض النووي غير الترميز دون إدراج الطفرات غير المقصودة29. وترد هنا منهجية مفصلة للمعالجة المسبقة للمراكز والبلدان المتوسطة الدخل من أجل التطبيقات في بيولوجيا الخلايا الجذعية والتمايز الموجه.
Protocol
1. صيانة الخلايا الجذعية ملاحظة: ينطبق بروتوكول صيانة الخلايا الموضح أدناه على الخلايا الجذعية البلوية (PSCs) التي يتم الحفاظ عليها في طبقة أحادية ملتصقة. يمكن تعديل وسائل الإعلام، والكواشف الأخرى، ولوحات زراعة الخلايا المستخدمة قبل علاج DMSO حسب الحاجة. بالنسبة لجميع البروتوكولات التالية في هذه المخطوطة، يجب التعامل مع الخلايا تحت خزانة السلامة البيولوجية. معطف معقمة، 6 جيدا، لوحات معالجة ثقافة الأنسجة مع مصفوفة متعددة القوى خلية الجذعية المؤهلة أو الركيزة المعدة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وحضانة لمدة ساعة على الأقل في حاضنة CO2 (5٪ CO2،جو رطب). لوحات المغلفة يمكن أن تكون ملفوفة الفيلم وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. إذابة PSCs المحفوظة بالتبريد في حمام مائي 37 درجة مئوية. تعقيم قارورة مع الإيثانول قبل إدخال إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، ثم نقل الخلايا على الفور عن طريق الأنابيب إلى أنبوب مخروطي معقمة تحتوي على 5-10 مجلدات من وسائل الإعلام الخلايا الجذعية prewarmed. طرد مركزي الخلايا في 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). يستنشق وسائل الإعلام وإعادة تعليق بلطف بيليه الخلية في 1 مل من وسائل الإعلام الخلايا الجذعية تستكمل مع مثبطات روك 10 μM، مثل Y-27632. يستنشق مصفوفة الثقافة من لوحة والبذور الخلايا في الكثافة المطلوبة، وعادة 0.5-1 × 106 الخلايا في جيدا في ما لا يقل عن 2 مل من وسائل الإعلام الخلايا الجذعية في بئر.ملاحظة: يمكن أن تختلف كثافة الطلاء عبر خطوط الخلايا المختلفة، واستنساخ وينبغي تحسينوفقا لذلك. الحفاظ على الخلايا عن طريق استبدال مع وسائل الإعلام الخلايا الجذعية prewarmed يوميا. تقسيم الخلايا في ما يقرب من 70٪ -80٪ من الملاءمة أو عندما تبدأ مستعمرات الخلية في إجراء اتصال. لتقسيم الخلايا، يستنشق وسائل الإعلام ويغسل الخلايا مرة واحدة مع PBS المعقمة. احتضان الخلايا مع 1 مل من محلول إنزيم التفكك في بئر لمدة 5-10 دقائق في 37 درجة مئوية. غسل وإعادة تعليق الخلايا مع وسائل الإعلام الخلايا الجذعية prewarmed ونقل إلى أنبوب مخروطي معقمة مع 5-10 مجلدات من وسائل الإعلام الخلايا الجذعية. اتبع الخطوات 1.3-1.7 للوحة الخلايا. 2. DMSO المعالجة المسبقة ملاحظة: عند طلاء الخلايا للعلاج المسبق DMSO قبل التمايز، ينبغي تحسين كثافة خلية الطلاء بدءا مع النظر في معدل النمو النموذجي للخط الجذعية، فضلا عن بروتوكول التمايز المستخدمة. التحقق من صحة تعدد القوى باستخدام العلامات التقليدية، حسب الضرورة. يجب أن يتم مرور الخلايا على الأقل 1x-2x بعد الذوبان الأولي قبل التمايز. 2D الثقافة التمايز عندما تصل الخلايا إلى الملاءمة المناسبة، وإعداد لوحات المغلفة، وفصل الخلايا، وإعداد تعليق خلية واحدة كما هو موضح أعلاه. عد الخلايا الحية باستخدام مقياس الهيموكيتوميأو عداد الخلايا التلقائي بما في ذلك الأزرق تريبان أو علامة صلاحية أخرى. لوحة الخلايا على لوحة مغلفة 6 جيدا في 0.5-1 × 106 خلايا في وسائل الإعلام الخلايا الجذعية جيدا مع مثبطات روك 10 μM.ملاحظة: بالنسبة لخطوط الخلايا التي تم اختبارها في مختبرنا، فإن هذه الكثافات عادة ما تؤدي إلى 80%-90% من الخلايا المتجانسة داخل المعالجة المسبقة لـ DMSO 24 ساعة. السماح للخلايا لاحتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 (5٪ CO2،الغلاف الجوي الرطب). إعداد 1٪ -2٪ DMSO في وسائل الإعلام الخلايا الجذعية قبل الدفء (على سبيل المثال، 100 درجة مئوية من DMSO في 10 مل من وسائل الإعلام = 1٪ DMSO الحل، أو 200 درجة مئوية DMSO في 10 مل من وسائل الإعلام = 2٪ DMSO الحل). بعد 24 ح الحضانة، يستنشق وسائل الإعلام من الخلايا واستبدالها مع حل DMSO. السماح للخلايا لاحتضان لمدة 24 ساعة إلى 48 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 (5٪ CO2،الغلاف الجوي الرطب) قبل التمايز.ملاحظة: عادة، علاج DMSO 24 ساعة كافية عبر غالبية خطوط ESC البشري وiPSC. خطوط الخلايا مع معدلات نمو بطيئة جدا (مرات مضاعفة طويلة) يمكن أن تستفيد من 48 ح الحضانة مع DMSO. ل48 ح حضانة مع DMSO، يمكن استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام الخلايا الجذعية الطازجة مع 1٪ -2٪ DMSO بعد أول 24 ساعة من العلاج. التمايز الثقافي ثلاثي الدّي: عندما تصل الخلايا إلى الملاءمة المناسبة، تتفكك وتجمع الخلايا في تعليق الخلية كما هو موضح أعلاه. عد الخلايا الحية باستخدام مقياس الهيموكيتوماتأو عداد الخلايا التلقائي بما في ذلك علامة البقاء. لوحة الخلايا في غير المغلفة، وانخفاض المرفق 6 لوحة جيدا في 0.5-1 × 106 الخلايا في وسائل الإعلام الخلايا الجذعية مع 10 م مثبطات ROCK.ملاحظة: بالنسبة لخطوط الخلايا التي تم اختبارها في مختبرنا، تؤدي هذه الكثافات عادة إلى تشكيل المجال hPSC ثلاثي الدناق ضمن 24 ساعة من خلايا الإعداد. السماح للخلايا لاحتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 (5٪ CO2،الغلاف الجوي الرطب). إعداد 1٪ -2٪ DMSO في وسائل الإعلام الخلايا الجذعية قبل التسخين (على سبيل المثال، 100 درجة مئوية من DMSO في 10 مل من وسائل الإعلام = 1٪ DMSO الحل، أو 200 ميكرولتر من DMSO في 10 مل من وسائل الإعلام = 2٪ DMSO الحل). يستعاض عن وسائط الإعلام باتباع الإجراءات المعيارية (على سبيل المثال، إمالة اللوحة بزاوية 30-45 درجة للسماح لمجالات الخلايا بالاستقرار في أسفل البئر؛ ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي معقم والسماح لمجالات الخلايا بالاستقرار في أسفل الأنبوب؛ أو جمع الخلايا بلطف ن تعليق باستخدام ماصة 5 أو 10 مل في أنبوب مخروطي معقمة وخلايا الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT). قم بإستنسخ الوسائط من الخلايا واستبدلها بحل DMSO، والأنابيب بلطف. السماح للخلايا باحتضان 24 ساعة إلى 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 (5٪ CO2،الغلاف الجوي الرطب) قبل التمايز.ملاحظة: عادة، علاج DMSO 24 ساعة كافية عبر غالبية خطوط ESC البشري وiPSC. خطوط الخلايا مع معدلات نمو بطيئة جدا (مرات مضاعفة طويلة) يمكن أن تستفيد من 48 ح الحضانة مع DMSO. ل48 ح حضانة مع DMSO، يمكن استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام الخلايا الجذعية الطازجة مع 1٪ -2٪ DMSO بعد أول 24 ساعة من العلاج. 3. التمايز إلى الطبقات الجرثومية الأولية ملاحظة: يصف ما يلي الأساليب التي ثبت سابقا أن تكون فعالة في مختبرنا لPSCs نمت في طبقة أحادية على 6 لوحات الآبار. وينبغي استخدام أي بروتوكول تمايز من الاختيار بعد معاملة DMSO لتعزيز التمايز في السلالات المطلوبة. إزالة حل DMSO بعد العلاج 24-48 ساعة والمضي قدما في التفريق بعد البروتوكولات القياسية. تمايز إندوسديرم (مقتبسة من كرون وآخرون30) خلايا Pretreat مع DMSO كما هو موضح أعلاه للثقافات 2D. إعداد حلول الأسهم Wnt3a وActivin A. إعداد اليوم 1 وسائل الإعلام التمايز endodermal عن طريق إضافة Wnt3a إلى التركيز النهائي من 20 نانوغرام / مل وActivin A إلى تركيز نهائي من 100 نانوغرام / مل إلى الحجم المناسب من وسائل الإعلام RPMI prewarmed. بعد المعالجة المسبقة DMSO، يستنشق وسائل الإعلام من الخلايا واستبدالها مع وسائل الإعلام اليوم 1 (على سبيل المثال، 2 مل لكل بئر من لوحة بئر 6). السماح للخلايا لاحتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 (5٪ CO2،الغلاف الجوي الرطب). إعداد اليومين 2 و 3 وسائل الإعلام التمايز endodermal عن طريق إضافة Activin A إلى التركيز النهائي من 100 نانوغرام / مل إلى الحجم المناسب من وسائل الإعلام RPMI prewarmed. يستنشق الوسائط من الخلايا واستبدالها بوسائط اليوم الثاني (على سبيل المثال، 2 مل لكل بئر من لوحة 6 بئر). السماح للخلايا لاحتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 (5٪ CO2،الغلاف الجوي الرطب). يستنشق الوسائط من الخلايا واستبداله اعلام اليوم الثالث (على سبيل المثال، 2 مل لكل بئر من لوحة 6 جيدا). تمايز Mesoderm (مقتبسة من تشانغ وآخرون31) تراجع الخلايا مع DMSO كما هو موضح أعلاه للثقافات 2D. إعداد حلول الأسهم Wnt3a وActivin A. إعداد وسائل الإعلام التمايز mesodermal عن طريق إضافة Wnt3a إلى التركيز النهائي من 20 نانوغرام / مل وأأكتيفين A إلى تركيز نهائي من 100 نانوغرام / مل إلى الحجم المناسب من وسائل الإعلام RPMI المتقدمة prewarmed. بعد المعالجة المسبقة DMSO، يستنشق وسائل الإعلام من الخلايا واستبدالها بوسائط تمايز (على سبيل المثال، 2 مل لكل بئر من لوحة بئر 6). السماح للخلايا لاحتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 (5٪ CO2،الغلاف الجوي الرطب). تمايز إكتودرم (مقتبسة من Chambers et al.32) تراجع الخلايا مع DMSO كما هو موضح أعلاه للثقافات 2D. إعداد حلول الأسهم Noggin وSB431542. إعداد وسائل الإعلام قاعدة التمايز ectodermal عن طريق حل استبدال المصل بالضربة القاضية (KOSR) إلى تركيز نهائي من 10٪ في DMEM بالضربة القاضية.ملاحظة: إعداد ما يكفي من وسائل الإعلام الأساسية لمدة 3-4 أيام من تغيير وسائل الإعلام. إعداد وسائل الإعلام التمايز ectodermal عن طريق إضافة نوجين إلى التركيز النهائي من 500 نانوغرام / مل وSB431542 إلى تركيز نهائي من 10 درجة مئوية إلى الحجم المناسب من KOSR/ خروج المغلوب DMEM. بعد المعالجة المسبقة DMSO، يستنشق وسائل الإعلام من الخلايا واستبدالها بوسائط تمايز (على سبيل المثال، 2 مل لكل بئر من لوحة بئر 6). السماح للخلايا لاحتضان لمدة 3-4 أيام في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 (5٪ CO2،جو رطب)، واستبدال وسائل الإعلام يوميا مع عوامل التمايز المضافة حديثا. 4. التمايز إلى أنواع الخلايا السلف يصف ما يلي الأساليب التي ثبت سابقا أن تكون فعالة في مختبرنا لPSCs نمت في الثقافات 2D أو 3D. وينبغي استخدام أي بروتوكول تمايز من الاختيار بعد معاملة DMSO لتعزيز التمايز في السلالات المطلوبة. إزالة حل DMSO بعد العلاج 24-48 ساعة والمضي قدما في التفريق بعد البروتوكولات القياسية. تمايز الخلايا العصبية السلف (مقتبسة من Tchieu et al.33) إعداد 6 لوحات جيدا عن طريق طلاء مع خلية جذعية متعددة القوى المؤهلة مصفوفة عامل النمو المنخفض أو الركيزة، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، لمدة ساعة على الأقل في حاضنة CO2 (5٪ CO2،الغلاف الجوي الرطب). لوحات المغلفة يمكن أن تكون ملفوفة الفيلم وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع. لوحة PSCs كما هو موضح أعلاه في كثافة 0.5-1 × 106 خلايا لكل بئر في وسائل الإعلام الخلايا الجذعية التي تحتوي على مثبطات ROCK. خلايا Pretreat مع DMSO كما هو موضح أعلاه للثقافات 2D. إعداد مثبطات كيميائية صغيرة LDN193189، SB431542، وXAV939 حلول الأسهم. إعداد أيام 1-3 الوسائط التمايز neuroectoderm عن طريق استكمال الأساسية 6 وسائل الإعلام مع 500 nM LDN193189، 10 μM SB431542، و 2 μM XAV939. بعد المعالجة المسبقة DMSO، يستنشق وسائل الإعلام واستبدالها بـ Days 1-3 neuroectoderm media (على سبيل المثال، 2 مل لكل بئر من لوحة 6 بئر). تغيير الوسائط يوميًا. إعداد أيام 4-12 الوسائط التمايز neuroectoderm عن طريق استكمال الأساسية 6 وسائل الإعلام مع 500 nM LDN193189 و 10 ميكرومتر SB431542. في اليوم 4 من التمايز، يستنشق وسائل الإعلام واستبدال مع أيام 4-12 وسائل الإعلام neurodectoderm. تغيير وسائل الإعلام يوميا. بعد 12 يوما من التمايز، يجب أن تعبر الخلايا المتمايزة عن علامات مناسبة لخلايا السلف العصبية (NPCs). يمكن الحفاظ على NPCs في وسائل الإعلام العصبية التي تحتوي على DMEM /F-12، 2٪ B-27، 1٪ N-2، وتستكمل مع عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية 10 ميكروغرام / مل (bFGF). مرور NPCs عند التجهم باستخدام حل مفرزة الخلية، والطلاء NPCs في 0.5-1 × 106 خلايا لكل بئر. تمايز الخلايا السلف أوليغودندروسيت (تكييفها من دوفاراس وفوساتي34) لوحة PSCs كما هو موضح أعلاه في كثافة 1 × 105 في بئر على لوحات الآبار المغلفة 6 في وسائل الإعلام الخلايا الجذعية التي تحتوي على مثبطات ROCK. خلايا Pretreat مع DMSO كما هو موضح أعلاه للثقافات 2D. إعداد SB431542، LDN193189، جميع عبر حمض الريتينويك (RA)، وسلس ناهض (SAG) حلول الأسهم. إعداد أيام 0-8 وسائط التمايز عن طريق استكمال DMEM / F-12 مع 10 μM SB431542، 250 nM LDN193189، و 100 NM RA. بعد المعالجة المسبقة DMSO، وحضانة الخلايا مع وسائل الإعلام التمايز لمدة 8 أيام، وتغيير وسائل الإعلام يوميا مع عوامل التمايز المضافة حديثا (على سبيل المثال، 2 مل لكل بئر من لوحة الآبار 6). في اليوم 8، استبدال وسائل الإعلام مع DMEM / F-12 التي تحتوي على 1X MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEA) الحل، 1X L-الجلوتامين، 2-mercaptoethanol، البنسلين / العقديات، و 1X N-2 تكمل 100 NM RA و 1 μM SAG. تغيير وسائل الإعلام يوميا. بعد 12 يوما من التمايز، يجب أن تعبر الخلايا المتمايزة عن علامات مناسبة من الخلايا السلف oligodendrocyte (OPCs). تمايز خلايا ذرية الغدد الصماء (مقتبسة من Pagliuca وآخرون35) بذور PSCs في 6 × 105 خلايا / مل في وسائل الإعلام الخلايا الجذعية بالإضافة إلى 10 م مثبطات ROCK في 500 مل قوارير الدوار وضعت على لوحة 9-موقف ضجة تعيين بمعدل دوران من 70 دورة في الدقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2،والرطوبة 100٪. السماح للكتل لتسوية في الجزء السفلي من قارورة، يستنشق وسائل الإعلام، ثم تراجع مع 1٪-2٪ DMSO. إعداد Activin A، Chir99021، KGF، Sant1، جميع عبر حمض الريتينويك (RA)، LDN193189، PdBU، XXI، Alk51، T3، وحلول الأسهم Betacelluin. إعداد وسائط الوسائط الأساسية للتمايز استناداً إلى الصياغة الواردة في الجدول 3. بعد المعالجة المسبقة DMSO، يستنشق وسائل الإعلام واستبدالها بوسائط S1 تكملها 100 نانوغرام/مل أكتيفين A و 3 mM Chir99021 (على سبيل المثال، 500 مل لكل قارورة). السماح بالحضانة لمدة 24 ساعة. في اليوم 2، استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام S1 تستكمل مع 100 نانوغرام /ملتر Activin A. السماح الحضانة لمدة 2 أيام. في اليوم 4، استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام S2 تستكمل مع 50 نانوغرام /مل KGF. السماح بالحضانة لمدة 3 أيام، وتغيير وسائل الإعلام بعد اليومين الأولين (اليوم 6). في اليوم 7، استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام S3 تستكمل مع 50 نانوغرام/مل KGF، 0.25 mM Sant1، 2 MM RA، و 200 nM LDN193189. السماح بالحضانة لمدة 24 ساعة. في اليوم 8، استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام S3 تستكمل مع 50 نانوغرام /مل KGF، 0.25 mM Sant1، 2 MM RA، 200 nM LDN193189، و 500 nM PdBU. السماح بالحضانة لمدة 24 ساعة. في اليوم 9، استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام S3 تستكمل مع 50 نانوغرام /مل KGF، 0.25 mM Sant1، و 100 نانومتر RA. السماح بالحضانة لمدة 5 أيام، وتغيير وسائل الإعلام كل يومين (اليوم 11 و 13). في اليومين 14 و 16، استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام S5 تكملها 0.25 mSant1، 100 NM RA، 1 mM XXI، 10 mM Alk5i II، 1 MM T3، و 20 نانوغرام /مل بيتاسيلولين (4 أيام الحضانة الإجمالية). في اليومين 18 و 20، استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام S5 تستكمل مع 25 NM RA، 1 MM XXI، 10 mM Alk5i II، 1 MM T3، و 20 نانوغرام / مل بيتاسيلولين. 5. التحقق من صحة التمايز المناعي الكيميائي ملاحظة: تصف الطرق التالية بروتوكولًا كيميائيًا مناعيًا عامًا يمكن تعديله حسب الحاجة. الأجسام المضادة الأولية هي تلك التي تم التحقق من صحتها سابقا في مختبرنا. ويمكن أيضاً استخدام تقنيات أخرى للتحقق من التمايز (مثل قياس التدفق الخلوي، وqPCR، وتسلسل الحمض النووي الريبي، والنشاف الغربي، والاختبارات الوظيفية، وما إلى ذلك). خلايا وضع العلامات المناعية بالنسبة للثقافات ثلاثية الدناق في التعليق، تتوزع مجموعات الخلايا الكاملة أو الألواح في تعليق خلية واحدة على لوحات مغلفة لمدة 18-24 ساعة قبل التثبيت. يستنشق وسائل الإعلام من الخلايا الملتصقة وغسل لفترة وجيزة مع PBS في RT على شاكر. لتثبيت الخلية، يستنشق PBS والخلايا الحاضنة مع 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) في PBS لمدة 20 دقيقة في RT على شاكر. تحذير: </ وينبغي إعداد مخزون PFA تحت غطاء الدخان بسبب سميته. لا تستنشق وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة. إزالة PFA وتجاهل في حاوية النفايات الكيميائية المناسبة. غسل الخلايا 3X مع PBS لمدة 5 دقائق على الأقل لكل غسل في RT على شاكر. لنفاذ الخلية وحجب، وحضانة الخلايا مع مصل الحمار 5٪ أعدت في 0.3٪ تريتون-X 100/PBS لمدة 1 ساعة في RT على شاكر. إعداد الحل الأساسي للجسم المضاد في نفس الحل المستخدم للنفاذية / حجب. حضانة في حل الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على شاكر. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، وغسل الخلايا 3X مع PBS لمدة 5 دقائق على الأقل لكل غسل في RT على شاكر. إعداد حل الأجسام المضادة الثانوية في نفاذيبيليتي / حظر الحل. السماح لاحتضان في حل الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في RT على شاكر. أسطي حل الأجسام المضادة الثانوية وغسل الخلايا 3X مع PBS لمدة 5 دقائق على الأقل لكل غسل في RT على شاكر. حضانة الخلايا مع DAPI أو علامة أخرى مفضلة لوقت الحضانة المناسبة، وشطف في PBS. تحديد كمية الصورة الحصول على ما لا يقل عن ثلاث صور لكل شرط على المجهر الفلورسنت و / أو مع منصة فحص المحتوى العالي. تحديد النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لكل علامة عن طريق حساب العدد الإجمالي للخلايا الملونة الأجسام المضادة وأرقام الخلايا الإجمالية (استناداً إلى تلطيخ النوى DAPI/Hoechst) باستخدام برنامج تصوير غير متحيز (على سبيل المثال، ImageJ) أو منصة فحص آلية لـ تحليلات.
Representative Results
مورفولوجيا DMSO المعالجة iPSCsوقد استُرُكَت الـ iPSCs البشرية المستمدة من مواضيع التحكم إما في طبقة أحادية 2D ملتصقة أو في مجالات الخلايا ثلاثية الأبعاد المعلقة. تقريبا 24 ح بعد الطلاء الأولي، تم التعامل مع الخلايا إما مع 1٪ أو 2٪ DMSO لمدة 24 ساعة في وسط الصيانة. تظهر صور brightfield التمثيلية بعد علاج DMSO في الشكل 1. واتساقا ً مع التقارير السابقة المتعلقة بالمناطق المتوسطة الدخل المحتفظ بها في طبقة أحادية3،أدت المعالجة المسبقة لـ DMSO إلى انخفاض عابر يعتمد على الجرعة في معدل النمو مقارنة بالخلايا المعالجة غير DMSO (الشكل1ألف). ويرتبط هذا الانتشار انخفاض مع زيادة في الاتصال من خلية إلى خلية، وهو واضح بشكل خاص في الخلايا المعالجة DMSO 2٪ تظهر تشكيل متزايد من مستعمرات الخلايا أكثر تكتلا. وفي أنواع الخلايا الأخرى، تبين أن القبض على G1 الناجم عن DMSO يرتبط بزيادة التعبير عن البروتينات المشاركة في تفاعلات الخلايا الخلوية التي تدعم تثبيط الاتصال الناجم عن اعتقال النمو36. وفي المجالات التي تحتفظ بها الـ iPSCs كمجالات خلايا ثلاثية الجوانب، زاد علاج DMSO بالمثل من عدد مجالات الخلايا (الشكل1باء). وعلاوة على ذلك، أدى علاج DMSO أيضا في أحجام المجال 3D متغير أقل، والتي ثبت سابقا أن يدل على تحسين قدرة التمايز من الخلايا37. والأهم من ذلك، لم يسفر 1 في المائة أو 2 في المائة من DMSO عن سمية الخلايا، مقيسة بأرقام القدرة على البقاء (ن = 3؛ ثقافة 2D٪ يعيش = السيطرة: 80 ± 1.3؛ 1٪ DMSO: 82 ± 3.7، 2٪: 81 ± 2.7؛ ثقافة 3D٪ العيش = السيطرة: 81 ± 4.3؛ 1٪ DMSO: 82 ± 6.7، 2٪: 82 ± 2.7). وعموما، فإن هذه النتائج تتفق مع فكرة أن العلاج DMSO يغير دورة الخلايا وأنماط النمو في الخلايا الجذعية المستزرعة. هذه الآثار على تثبيط النمو قابلة للعكس عندما تتم إزالة DMSO من المتوسط، كما هو مبين سابقا3. علاج DMSO يحسن تمايز ESCs إلى الطبقات الجرثومية الأوليةوقد بذر تقوية HUES6 hESCs على لوحات مغلفة لمدة 24 ساعة تليها العلاج مع 2٪ DMSO لمدة 24 ساعة في وسط الصيانة. ثم تم تمييز الخلايا في ثلاث طبقات الجرثومية الأولية بعد نماذج العلاج المبينة في الشكل 2A30،31،32. ثم تم إصلاح الخلايا المتمايزة وملطخة مناعية للعلامات البروتوميبيك من كل طبقة جرثومية (SOX17 لendoderm، وbrachyury لmesoderm، وSOX1 لectoderm). كما هو مبين في الشكل 2باء، 24 ساعة من المعالجة المسبقة مع 2٪ DMSO زيادة نسبة الخلايا التي تعبر عن كل علامة طبقة جرثومية. وهذا يتسق مع التقارير السابقة من مختبرنا تظهر زيادة النشاط المناعي، والتعبير الجيني، فضلا عن العدد المطلق من الخلايا المتمايزة نحو جميع الطبقات الجرثومية في الخلايا الجذعية المعالجة مع DMSO3،5. HUES6 هو خط hESC مع ميل منخفض جداللتمايز عبر جميع السلالات 1، ومع ذلك فإن العلاج DMSO يحسن إلى حد كبير قدرته على التمييز عبر جميع الطبقات الجرثومية. علاج DMSO يحسن التمايز لأنواع الخلايا السلفللتحقيق في تأثير DMSO على التمايز لأنواع الخلايا السلف الجهاز العصبي القومي، تم تمييز iPSCs البشرية إما إلى الخلايا السلف العصبية (NPCs) أو خلايا ذرية oligodendrocyte (OPCs). لتوليد NPCs، تم التعامل مع الخلايا مسبقا مع DMSO 2٪ لمدة 24 ساعة في وسط الصيانة تليها 12 يوما من التمييز الموجه33 (الشكل3ألف). كما هو مبين في الشكل 3باء،2٪ DMSO المعالجة المسبقة زيادة التعبير عن علامة المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني PAX6 بالمقارنة مع السيطرة. وباستخدام بروتوكول آخر تم التحقق منه سابقاً34 (الشكل3جيم)،تم تمييز المراكز الدولية للدعم في الخدمات لمدة 12 يوماً في البلدان التي تم التحقق منها سابقاً في البلدان التي تم التحقق من صحتها. وعلى غرار المراكز الوطنية للشرطة النووية، أظهرت الملوثات الإجمالية المعالجة من النقاط المعالجة المسبقة للملوثات المتوسطة الدخل المستمدة من الـ iPSCs التي عولجت مسبقاً بنسبة 2 في المائة من الـ DMSO لمدة 24 ساعة زيادة في نسبة الخلايا التي تعبر عن علامات OPC OLIG2 (الشكل3دال). يستمر العلاج الأولي DMSO لتعزيز التمايز في أنواع الخلايا الناضجةوللتحقيق في تأثير DMSO على المراحل الأخيرة من بروتوكول التمايز، تم إجراء علاج مسبق لـ HUES8 hESCs لمدة 24 ساعة مع 2% DMSO قبل التمايز إلى خلايا β بعد بروتوكول تمايز موجه لمدة 20 يومًا يرد وصفه في الشكل4(أ) 35.وقد استخدمت HUES8 كما ثبت سابقا أن لديها ميل أعلىنحو النسب endodermal 1،38. في مرحلة endoderm محددة، والخلايا المتمايزة التعبير SOX17 وFOXA2، endoderm النهائي (DE) علامات محددة. مع مزيد من التمايز في الذريةالبنكرياس (PP 1) المرحلة، والخلايا المتمايزة التعبير PDX1 وFOXA2، علامات مميزة من خلايا ذرية البنكرياس. في هذه المراحل من تمايز خلايا البنكرياس، كانت كفاءة الحث في DE وبعد ذلك في PP1 عالية لكل من السيطرة وDMSO المعالجة hESCs متباينة في كل من هذه المراحل (الشكل4B، المراحل 1 و 3). على الرغم من أن خط الخلية HUES8 قد لوحظ أن زيادة الميل إلى التفريق في سلالة endodermal، كما يتم حث مزيد من التمايز في أنواع الخلايا أكثر تخصصا في المراحل النهائية hESCs المعالجة DMSO هي أكثر من ذلك بكثير من المرجح أن تنتج خلايا الغدد الصماء البنكرياس ناضجة. وكانت كفاءة توليد خلايا استواء البنكرياس PDX1/NKX6.1+ وخلايا الغدد الصماء Neurogenin 3+ وخلايا NKX6.1/C-peptide+ SC-β أعلى بكثير في hESCs المعالجة بـ DMSO (الشكل4B،المرحلتان 4 و5). وتتماشى هذه النتائج مع تمايز المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني ولجنة حماية البيئة في هذا العام الذي يبين أن DMSO يعزز إمكانية التمايز لأنواع خلايا الذرية، كما يبين أن تأثير DMSO مستمر في توليد أنواع خلايا أكثر تخصصاً. وهذا يتسق مع العمل السابق، حيث أظهرنا أن العلاج الأولي 24 ساعة DMSO يزيد التمايز في أنواع الخلايا الطرفية عبر الطبقات الجرثومية، بما في ذلك في الخلايا العصبية وكذلك ضرب خلايا القلب31،39 في خطوط الخلايا مع الميل عالية أو فقيرة للتمايز3. العلاج الأولي DMSO يحسن وظيفة الخلية المستمدة من hESC التالية في زرع الجسم الحيفي السابق، أظهرنا فعالية العلاج DMSO في تعزيز التمايز من hESCs في خلايا ذرية البنكرياس الوظيفية التي تظهر في وقت لاحق تحسنا ملحوظا في إفراز الأنسولين في الجسم الحي3. باستخدام البروتوكولات المنشورة سابقا3،30،40، تم التعامل مع هويس8 HESCs HUES مع 1 ٪ DMSO لمدة 24 ساعة ، وتميز في خلايا ذرية البنكرياس ، وزرعها في الفئران SCID البيج نقص المناعة لتقييم وظيفة (على سبيل المثال، إفراز الأنسولين استجابة لتحدي الجلوكوز أو تحفيز KCl) (الشكل5A). في حين أن كفاءة التمايز في FOXA2 + (~ 90٪) وPDX1+ (~ 75٪) كانت ذرية البنكرياس قابلة للمقارنة بين التحكم وhESCs المعالجة DMSO (الشكل5B) لخط HUES8 hESC، والخلايا المتمايزة عن hESCs بعد 24 ساعة 1٪ علاج DMSO قد تحسنت الاستجابة للجلوكوز وKCl التحفيز التالية في زرع الجسم الحي. وكانت التحسينات في الوظائف واضحة في غضون أسبوعين بعد الزرع (الشكل5جيم) واستمرت حتى 16 أسبوعا على الأقل بعد الزرع (الشكل5دال). وإذا ما أخذت هذه النتائج مجتمعة، فإنها تشير إلى أن المعالجة المسبقة لـ DMSO لا تزيد فقط من كفاءة التمايز في الطبقات الجرثومية، وخلايا السلف، وأنواع الخلايا الأكثر نضجاً، ولكن أيضاً أنها تستمر في تعزيز وظائف الخلايا المتمايزة في الجسم الحي. نوع الخلية المتمايزة بدء تشغيل نوع الخلية %DMSO طول علاج DMSO طول علاج DMSO الخلايا الكبدية Escخط خلية ورم الهيباتوماEscEscالخلايا الجذعية mesenchymaliPSCsEscEscخط خلية ورم الهيباتوماEsc 1.01.01.00.5 0.50.1-2.01.01.00.5 0.51.00.6 8 أيامعدة أيام7 أيام10-14 يوما7-21 يوما7 أيام4 أيام5 أيام2-21 يوماطوال بسمة وآخرون، 2008[كنبرتّ] و [أندرسّون], 2008هاي وآخرون، 2009دوان وآخرون، 2010علي زاده وآخرون، 2014كوندو وآخرون، 2014Szkolnicka et al., 2014Czysz et al., 2015نيكولاو وآخرون، 2016Vanhove et al., 2016 الطبقات الجرثومية الأولية المراكز والبلدان التي تقدم خدمات دعم في خدمات الدعم في السنواتفى الوقت الواحدفى الوقت الواحد 0.1-2.00.5 0.50.1-2.0 24 ساعة24 ساعة24 ساعة شيتي وآخرون، 2013شيتي وآخرون، 2015لي وآخرون, 2018 خلايا القلب المراكز والبلدان التي تقدم خدمات دعم في خدمات الدعم في السنواتخلايا P19المراكز والبلدان التي تقدم خدمات دعم في خدمات الدعم في السنواتالخلايا الجذعية المسنشية الجنينية 0.1-2.01.01.0-2.00.8-1.0 24 ساعة4 أيام24-30 ساعة24 ساعة شيتي وآخرون، 2013تشوي وآخرون، 2014فان دن بيرغ وآخرون، 2016دنغ وآخرون، 2017 خلايا البنكرياس المراكز والبلدان التي تقدم خدمات دعم في خدمات الدعم في السنواتفى الوقت الواحد 0.1-2.00.5 0.5 24 ساعة24 ساعة شيتي وآخرون، 2013شيتي وآخرون، 2015 خلايا العضلات الملساء خلايا P19 1.0 4 أيام تشوي وآخرون، 2014 الخلايا البطانية خلايا P19 1.0 4 أيام تشوي وآخرون، 2014 الخلايا المعوية iPSCs 0-1.6 4 أيام أوجاكي وآخرون، 2015 ظهارة الأمعاء iPSCs 0-1.6 4 أيام أوجاكي وآخرون، 2015 الخلايا العصبية Marmoset iPSC 0.05-2.0 24 ساعة تشيو وآخرون، 2015 العدلات خط خلايا ابيضاض الدم 1.25 6-8 أيام تيموريان وموغانلو، 2016 أنابيب العضلات والهيكل العظمي iPSCs 1.5 24 ساعة سوارتز وآخرون، 2016 الجهاز القشري في ما يُالتّز 1.0 24 ساعة يون وآخرون, 2018 الجدول 1: موجز الأعمال المنشورة سابقاً التي تبين الآثار المفيدة لمعاملة DMSO على التمايز. S1 S2 S3 S5 MCDB131 (L) 1 1 1 1 الجلوكوز (ز) 0.44 0.44 0.44 3.6 (ز) 2.46 1.23 1.23 1.754 FAF-BSA (ز) 20 20 20 20 (مل) 0.02 0.02 5 5 الجلوتاماكس (مل) 10 سنوات 10 سنوات 10 سنوات 10 سنوات فيتامين C (ملغ) 44 44 44 44 الهيبارين (ملغ) صفر صفر صفر 10 سنوات P/S (مل) 10 سنوات 10 سنوات 10 سنوات 10 سنوات الجدول 2: مكونات الغدد الصماء ذرية خلية التمايز وسائل الإعلام الأساسية. الشكل 1 علاج DMSO يغير نمو hPSCs. (أ) الصور التمثيلية الساطعة للمصابين بالألغام المضادة للفلورة المطليين بطبقة أحادية بعد عدم تلقي أي علاج (مراقبة) أو علاج بنسبة 1 في المائة أو 2 في المائة من DMSO لمدة 24 ساعة. (ب) صور مشرقة تمثيلية من hiPSCs مطلية على لوحات منخفضة المرفقات للسماح تشكيل المجال 3D بعد تلقي أي علاج (السيطرة) أو العلاج مع 1٪ أو 2٪ DMSO لمدة 24 ساعة. بالمقارنة مع السيطرة. شريط مقياس = 500 درجة. الشكل 2 علاج DMSO يحسن التمايز من hPSCs إلى الطبقات الجرثومية الأولية. (أ) تخطيطي لبروتوكولات التمايز المستخدمة لتوليد الطبقات الجرثومية الأولية الثلاث. (ب) صور تمثيلية لـ HUES6 hESCs المتمايزة المسماة بـ SOX17 (endoderm) وbrachyury (mesoderm) وSOX1 (ectoderm). المعالجة المسبقة مع 2٪ DMSO لمدة 24 ساعة زادت من كفاءة التمايز عبر جميع الطبقات الجرثومية الثلاث. النسب المئوية للخلايا التي يتم تمييزها إلى SOX17+ endodermal، Brachyury (Brachy)+ mesodermal، أو SOX1+ الخلايا الخارجية بعد التمايز الموجه في كل طبقة جرثومية من السيطرة ويلاحظ hESCs المعالجة DMSO مع SEM من ثلاثة نسخ بيولوجية . غير المقترنة t-اختبار: endoderm ع = 0.0003; mesoderm p = 0.047; ectoderm p = 0.015. شريط مقياس = 50 درجة. الشكل 3 علاج DMSO يحسن التمايز لأنواع الخلايا السلف العصبية. (أ) مخطط بروتوكول التمايز المستخدم لتوليد خلايا السلف العصبية (NPCs). (ب) الصور التمثيلية للبلدان المتوسطة الدخل البشرية المتمايزة في NPCs مناعية لPax6. 24 ساعة من المعالجة المسبقة مع 2٪ DMSO زيادة عدد الخلايا الإيجابية PAX6. النسب المئوية للخلايا التي يتم تمييزها إلى Pax6+ NPCs بعد التمييز الموجه للتحكم وiPSCs البشرية المعالجة DMSO لوحظت مع SEM من ثلاثة عمليات تكرار بيولوجية. اختبار t غير المقترن: p = 0.0225. شريط مقياس = 200 درجة مئوية (C) مخطط بروتوكول التمايز المستخدم لتوليد خلايا ذرية oligodendrocyte (OPCs). (د) الصور التمثيلية للiPSCs البشرية المتمايزة في OPCs مناعية تحمل علامة OPC Olig2. 24 ساعة من المعالجة المسبقة مع 2٪ DMSO زيادة التعبير عن كل من علامات OPC مقارنة مع السيطرة. النسب المئوية للخلايا التي يتم تمييزها إلى Olig2+ OPCs بعد التمييز الموجه للتحكم وiPSCs البشرية المعالجة DMSO لوحظت مع SEM من أربعة نسخ بيولوجية. اختبار t غير المقترن: p = 0.0466. شريط مقياس = 50 درجة. الشكل 4 يعزز علاج DMSO إمكانية التمايز النهائي للمركبات المعالجة الفعالة. (أ) مخطط من ~ 20 يوما توجيه التمايز من هويس8 HESCs في خلايا الغدد الصماء البنكرياس متفاوتة بشكل نهائي. (ب) تلطيخ المناعة للعلامات المشار إليها في كل مرحلة من مراحل التمايز بعد التمايز الموجه لخلايا التحكم غير المعالجة والخلايا المعالجة مسبقا مع 2٪ DMSO لمدة 24 ساعة. يستمر العلاج الأولي DMSO لزيادة التمايز في أنواع خلايا الغدد الصماء الطرفية في المراحل الأخيرة من التمايز الموجه. ويلاحظ النسب المئوية للخلايا التي تميّز في العلامات المشار إليها في كل مرحلة من مراحل التمايز بعد التمايز الموجه للتحكم، ويلاحظ تُعالج الـ DMSO مع SEM من اثنين إلى أربعة تكرارات بيولوجية. شريط مقياس = 200 درجة. الشكل 5 العلاج الأولي DMSO من hPSCs يعزز استجابة الجلوكوز بعد زرع خلاياذرية البنكرياس في الجسم الحي . (أ) مخطط التمايز الموجه (~ 15 يوماً) من هويس ونس8 في خلايا ذرية البنكرياس (PP2)بعد عدم وجود علاج (السيطرة) أو 24 ساعة 1٪ DMSO العلاج وزرع لاحق (5 مليون خلية) إلى نقص المناعة الفئران SCID البيج. (ب) النسبة المئوية للخلايا التي تميز في PDX1+ وFOXA2 + خلايا ذرية البنكرياس بعد في المختبر توجيه التمايز من السيطرة وHESCs المعالجة DMSO مباشرة قبل زرع (ن = 1). (ج) متوسط قياسات ELISA للأنسولين البشري من مصل الفئران بعد انخفاض (2.5 مم) أو ارتفاع (15 ملي متر) تحدي الجلوكوز أو تحفيز كلوريد البوتاسيوم (KCl) في (C) 2 أسابيع و (D) 16 أسابيع بعد زرع البنكرياس وتختلف الخلايا السلف ية عن التحكم وhESCs المعالجة بـ DMSO (أشرطة الخطأ = SEM؛ n = 3 في أسبوعين و16 أسبوعاً للتحكم؛ n = 2 في 2 أسابيع و16 أسبوعاً لDMSO). ANOVA ثنائيالاتجاه: p = 0.0051 للتحكم مقابل DMSO في 2 أسابيع; p = 0.0116 للتحكم مقابل DMSO في 16 أسبوعا. الفئران درس في نقاط زمنية مختلفة مختلفة. يتم تكييف النتائج من Chetty وآخرون3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
وباختصار، يصف هذا البروتوكول أداة بسيطة وغير مكلفة لتعزيز قدرة التمايز للخلايا الجذعية متعددة القوى (PSCs) لجميع الطبقات الجرثومية الأولية، وأنواع مختلفة من خلايا السلف المتخصصة، وحتى أنواع الخلايا الناضجة الوظيفية في المختبر وفي إعدادات الجسم الحي. موضحة هي بروتوكولات تمايز محددة تم استنساخها بشكل فعال في مختبرنا وكذلك في مختبرات أخرى، ولكن يمكن استخدام أي بروتوكول تمايز من اختيارك بعد علاج DMSO. وكما هو مبين في الجدول1، أظهر عدد من المختبرات أيضاً تعزيزاً للتمايز بين الشركات بعد المعالجة العابرة لـ DMSO باستخدام نماذج مختلفة لتوليد أنواع مختلفة من الخلايا الطرفية الأخرى. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن الأساليب هنا تصف استخدام الـ PSCs البشري، فإن المعالجة المسبقة لDMSO يمكن استخدامها عبر الأنواع وقد ثبت أنها فعالة في الفئران والأرانب وPSCs الرئيسيات.
على الرغم من أن جرعات أعلى من DMSO من المعروف أن تكون سامة للخلايا، والجرعات المنخفضة المستخدمة في هذه الطريقة (1٪ -2٪) لفترة عابرة يؤدي إلى الحد الأدنى من موت الخلايا. في حين أن الأرقام الإجمالية للخلايا مباشرة بعد العلاج DMSO قد تنخفض بسبب تعزيز DMSO من اعتقال دورة الخلية في المرحلة G1 من دورة الخلية، وتظهر الدراسات السابقة أن الخلايا قادرة على الوصول إلى نفس مستوى الملاءمة كما الثقافات السيطرة بعد إزالة DMSO3.
يجب تحسين النسبة المئوية ومدة المعالجة المسبقة DMSO لكل خط الخلية. وينبغي تعديل وقت العلاج مع مراعاة لركوب الدراجات / مضاعفة الوقت من الخلايا. على سبيل المثال، PSCs الماوس عادة ما يكون أقصر بكثير أوقات ركوب الدراجات من حوالي 15 ساعة; وبالتالي، فإن علاج DMSO لمدة 15 ساعة لهذه الخلايا يكفي. كما وجدت بعض المختبرات أن علاج DMSO مفيد عند استمراره أثناء بروتوكول التمايز أو بتركيزات أقل (انظر الجدول1). وتجدر الإشارة إلى أن بعض خطوط PSC قابلة للتعديل بدرجة أكبر للتمييز بين سلالات محددة. فعلى سبيل المثال، تبين أن خلايا HUES6 أقل تساهلاً في التمايز، وبالتالي فقد تحسنت بشكل ملحوظ مع علاج DMSO (الشكل2). وكبديل لذلك، تبين أن خلايا HUES8 المستخدمة في الشكل 4 والشكل 5 لديها ميل أعلى نحو التمايز داخل الجلد؛ وهكذا، تم إظهار اختلافات أقل بين السيطرة وDMSO للتمايز في المراحل الأولية نحو endoderm النهائي. ومع ذلك، يلاحظ تعزيز المعالجة المسبقة لDMSO في مراحل لاحقة من التمايز في هذا الخط الخلوي (الشكل4باء). علاج DMSO هو أيضا تنوعا من حيث أنه فعال في كل من أنظمة الثقافات الخلية 2D و 3D، ويمكن استخدامه مع أنواع مختلفة من مواد الطلاء على لوحات ثقافة الخلية، ويعمل في أنواع مختلفة من وسائل الصيانة التي تعزز النمو والتوسع في hPSCs (على سبيل المثال، mTeSR، E8، وسائل الإعلام مكيفة MEF، الخ).
وبشكل أعم، تشير هذه النتائج إلى أن حالة بدء الخلايا الجذعية متعددة القوى لها تأثير قوي على الميل إلى التمايز الأولي وكذلك التمايز النهائي في أنواع الخلايا الوظيفية. لقد أظهرنا سابقا أن وظائف العلاج DMSO من خلال Rb في hPSCs3،5. Rb يلعب دورا هاما في تعزيز التمايز النهائي، وبقاء الخلية، والاستقرار الوراثي للخلايا41،42،43،44،وبالتالي قد يفسر الآثار المستمرة على الخلايا متمايزة عن hPSCs المعالجة بـ DMSO. وقد يؤدي استهداف هذه الأساليب المبكرة للتنظيم إلى وضع هذه المراكز على مسار أفضل للتمايز وتحسين فائدتها في الطب التجديدي في نهاية المطاف.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل بمنح من كلية الطب بجامعة ستانفورد وزمالة سيبيل الممنوحة لـ S.C.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353046 | |
| 9-Position stir plate | Chemglass | CLS-4100 | |
| Accutase | Gibco | 11105-01 | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| Advanced RPMI | Gibco | 12633012 | |
| Alk5i II | Axxora | ALX-270-445 | |
| all-trans retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| anti-Brachyury | R&D Systems | AF2085 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-C-peptide | Developmental Studies Hybridoma Bank | GN-ID4 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-FoxA2 | Millipore | 07-633 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-Nkx2.2 | University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-Nkx6.1 | University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank; | F55A12-supernatant | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-Olig2 | EMD Millipore | MABN50 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-Pax-6 | Biolegend | 901301 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-Pdx1 | R&D Systems | AF2419 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-SOX1 | R&D Systems | AF3369 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-SOX17 | R&D Systems | AF1924 | No variablity observed across different lot numbers |
| B-27 Supplement, minus Vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| basic fibroblast growth factor | Gibco | PHG0264 | |
| Betacellulin | Thermo Fisher Scientific | 50932345 | |
| Chir99021 | Stemgent | 04-000-10 | |
| CMRL 1066 | Corning | 99-603-CV | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAF1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Disposable Spinner Flasks | Corning, VWR | 89089-814 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Essential 6 Media | Gibco | A1516501 | |
| FAF-BSA | Proliant | 68700 | |
| FGF7 | PeproTech | 100-19 | |
| Geltrex | Gibco | A1413202 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Human Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO Diagnostics | 80-INSHUU-E01.1 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500056 | |
| KGF | Peprotech | AF-100-19 | |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| L-3,3′,5-Triiodothyronine (T3) | EMD Millipore | 642245 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354277 | |
| MCDB-131 | Cellgro | 15-100-CV | |
| MEM NEAA | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | StemCell Technologies | 5850 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| NaHCO3 | Sigma | S3817 | |
| Noggin Fc Chimera Protein | R&D Systems | 3344-NG-050 | |
| PdBU | EMD Millipore | 524390 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| Sant1 | Sigma-Aldrich | S4572 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Smoothened Agonist, SAG | EMD Millipore | 566660 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning | 3471 | |
| Vitamin C | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Wnt3a | R&D Systems | 5036-WN | |
| XAV 939 | Tocris | 3748 | |
| XXI | EMD Millipore | 565790 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72302 |
References
- Osafune, K., et al. Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines. Nature Biotechnology. 26 (3), 313-315 (2008).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Review Genetics. 15 (2), 82-92 (2014).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Conklin, J. F., Sage, J. Keeping an eye on retinoblastoma control of human embryonic stem cells. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (5), 1023-1030 (2009).
- Li, J., et al. A transient DMSO treatment increases the differentiation potential of human pluripotent stem cells through the Rb family. PLoS One. 13 (12), 0208110 (2018).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
- Pardee, A. B. G1 events and regulation of cell proliferation. Science. 246 (4930), 603-608 (1989).
- Orford, K. W., Scadden, D. T. Deconstructing stem cell self-renewal: genetic insights into cell-cycle regulation. Nature Review Genetics. 9 (2), 115-128 (2008).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
- Duan, Y., et al. Differentiation and characterization of metabolically functioning hepatocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (4), 674-686 (2010).
- Szkolnicka, D., Farnworth, S. L., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Deriving functional hepatocytes from pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 30, 1-12 (2014).
- Vanhove, J., et al. H3K27me3 Does Not Orchestrate the Expression of Lineage-Specific Markers in hESC-Derived Hepatocytes In Vitro. Stem Cell Reports. 7 (2), 192-206 (2016).
- Kanebratt, K. P., Andersson, T. B. Evaluation of HepaRG cells as an in vitro model for human drug metabolism studies. Drug Metabolism & Disposition. 36 (7), 1444-1452 (2008).
- Nikolaou, N., Green, C. J., Gunn, P. J., Hodson, L., Tomlinson, J. W. Optimizing human hepatocyte models for metabolic phenotype and function: effects of treatment with dimethyl sulfoxide (DMSO). Physiological Reports. 4 (21), (2016).
- Kondo, Y., et al. An efficient method for differentiation of human induced pluripotent stem cells into hepatocyte-like cells retaining drug metabolizing activity. Drug Metabolism Pharmacokinetics. 29 (3), 237-243 (2014).
- Alizadeh, E., et al. The effect of dimethyl sulfoxide on hepatic differentiation of mesenchymal stem cells. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44 (1), 157-164 (2016).
- Czysz, K., Minger, S., Thomas, N. DMSO efficiently down regulates pluripotency genes in human embryonic stem cells during definitive endoderm derivation and increases the proficiency of hepatic differentiation. PLoS One. 10 (2), 0117689 (2015).
- Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 5, 17297 (2015).
- Choi, S. C., et al. Mixl1 and Flk1 Are Key Players of Wnt/TGF-beta Signaling During DMSO-Induced Mesodermal Specification in P19 cells. Journal of Cellular Physiology. 230 (8), 1807-1821 (2015).
- Chetty, S., et al. A Src inhibitor regulates the cell cycle of human pluripotent stem cells and improves directed differentiation. Journal of Cell Biology. 210 (7), 1257-1268 (2015).
- Qiu, Z., et al. Marmoset induced pluripotent stem cells: Robust neural differentiation following pretreatment with dimethyl sulfoxide. Stem Cell Research. 15 (1), 141-150 (2015).
- Swartz, E. W., et al. A Novel Protocol for Directed Differentiation of C9orf72-Associated Human Induced Pluripotent Stem Cells Into Contractile Skeletal Myotubes. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1461-1472 (2016).
- Teimourian, S., Moghanloo, E. Thwarting PTEN Expression by siRNA Augments HL-60 Cell Differentiation to Neutrophil-Like Cells by DMSO and ATRA. DNA Cell Biology. 35 (10), 591-598 (2016).
- van den Berg, C. W., Elliott, D. A., Braam, S. R., Mummery, C. L., Davis, R. P. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes Under Defined Conditions. Methods in Molecular Biology. 1353, 163-180 (2016).
- Deng, F., et al. Combination of retinoic acid, dimethyl sulfoxide and 5-azacytidine promotes cardiac differentiation of human fetal liver-derived mesenchymal stem cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 147-159 (2016).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2018).
- Stratigopoulos, G., De Rosa, M. C., LeDuc, C. A., Leibel, R. L., Doege, C. A. DMSO increases efficiency of genome editing at two non-coding loci. PLoS One. 13 (6), 0198637 (2018).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nature Biotechnology. 26 (4), 443-452 (2008).
- Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
- Douvaras, P., Fossati, V. Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Fiore, M., Degrassi, F. Dimethyl sulfoxide restores contact inhibition-induced growth arrest and inhibits cell density-dependent apoptosis in hamster cells. Experimental Cell Research. 251 (1), 102-110 (1999).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
- Bock, C., et al. Reference Maps of human ES and iPS cell variation enable high-throughput characterization of pluripotent cell lines. Cell. 144 (3), 439-452 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- D’Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Jacks, T., et al. Effects of an Rb mutation in the mouse. Nature. 359 (6393), 295-300 (1992).
- Nguyen, D. X., Baglia, L. A., Huang, S. M., Baker, C. M., McCance, D. J. Acetylation regulates the differentiation-specific functions of the retinoblastoma protein. The EMBO Journal. 23 (7), 1609-1618 (2004).
- Slack, R. S., et al. Cells differentiating into neuroectoderm undergo apoptosis in the absence of functional retinoblastoma family proteins. Journal of Cell Biology. 129 (3), 779-788 (1995).
- Gu, W., et al. Interaction of myogenic factors and the retinoblastoma protein mediates muscle cell commitment and differentiation. Cell. 72 (3), 309-324 (1993).
Cite This Article
Sambo, D., Li, J., Brickler, T., Chetty, S. Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation. J. Vis. Exp. (149), e59833, doi:10.3791/59833 (2019).