Trattamento transitorio delle cellule staminali pluripotenti umane con DMSO per promuovere la differenziazione

1. Manutenzione delle cellule staminali NOT:</ Il protocollo di manutenzione cellulare descritto di seguito si applica alle cellule staminali pluipotenti (PSC) mantenute in un monostrato aderente. Supporti, altri reagenti e piastre di coltura cellulare utilizzate prima del trattamento DMSO possono essere regolati in base alle esigenze. Per tutti i seguenti protocolli in questo manoscritto, le cellule devono essere trattate sotto un armadietto di sicurezza biologica. Coat sterile, 6 pozzetti trattati con coltura tissutale con una matrice pluripotente qualificata per cellule staminali o substrato preparato secondo le istruzioni del produttore e incubare per almeno 1 h in un incubatore di CO2 (5% CO2, atmosfera umida). Le lastre rivestite possono essere avvolte e conservate a 4 gradi centigradi per un massimo di una settimana. Scongelare i PSC crioconservati in un bagno d’acqua a 37 gradi centigradi. Sterilizzare fiala con etanolo prima dell’introduzione all’armadietto di sicurezza biologica, quindi trasferire immediatamente le cellule tramite pipettaggio su un tubo conico sterile contenente 5-10 volumi di supporti preriscaldati di cellule staminali. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT). Aspirare i supporti e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 1 mL di supporti di cellule staminali integrati con un inibitore ROCK di 10 M, come Y-27632. Aspirare la matrice di coltura dalla piastra e semina le cellule alla densità desiderata, in genere 0,5-1 x 106 cellule per pozzo in almeno 2 mL di supporti per cellule staminali per bene. NOT:</ La densità di placcatura può variare su diverse linee cellulari e cloni e deve essere ottimizzata di conseguenza. Mantenere le cellule sostituendo con supporti di cellule staminali preriscaldate ogni giorno. Dividere le cellule a circa il 70%-80% di confluenza o quando le colonie cellulari iniziano a prendere contatto. Per la scissione delle cellule, aspirare il supporto e lavare le cellule una volta con PBS sterile. Incubare le cellule con 1 mL di una soluzione enzimatica di dissociazione per pozzo per 5-10 minuti a 37 . Lavare e sospendere le cellule con supporti di cellule staminali preriscaldate e trasferirle in un tubo conico sterile con 5-10 volumi di supporti di cellule staminali. Seguire i passaggi da 1,3 a 1,7 per placcare le celle. 2. Pretrattamento DMSO NOT:</ Quando si placcano le cellule per il pretrattamento DMSO prima della differenziazione, la densità cellulare di placcatura iniziale deve essere ottimizzata tenendo conto del tasso di crescita tipico della linea di cellule staminali e del protocollo di differenziazione utilizzato. Convalidare la pluripotenza utilizzando marcatori convenzionali, se necessario. Le cellule devono essere passaggiate almeno 1x-2x dopo lo scongelamento iniziale prima della differenziazione. Differenziazione della cultura 2D Quando le cellule raggiungono una confluenza appropriata, preparare piastre rivestite, dissociare le cellule e preparare una sospensione a cella singola come descritto sopra. Contare le cellule vive utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatico, incluso il blu trypan o un altro marcatore di vitalità. Placcare le cellule su una piastra di 6 pozzetti rivestita a 0,5-1 x 106 cellule per bene nel supporto delle cellule staminali con l’inibitore di 10 M ROCK. NOT:</ Per le linee cellulari testate nel nostro laboratorio, queste densità in genere hanno provocato 80%-90% cellule confluenti all’interno del 24 h pretrattamento DMSO. Permettere alle cellule di incubare per 24 h a 37 gradi centigradi in un’incubatrice di CO2 (5% CO2, atmosfera umida). Preparare 1%-2% DMSO su supporti di cellule staminali preriscaldate (ad es., 100 L di DMSO in 10 mL di media , 1% soluzione DMSO, o 200 DMSO l’L in 10 mL di media – soluzione DMSO 2%. Dopo 24 h incubazione, aspirare i supporti dalle cellule e sostituirli con la soluzione DMSO. Lasciare che le cellule incubano per 24 h a 48 h a 37 gradi centigradi in un’incubatrice di CO2 (5% CO2, atmosfera umida) prima della differenziazione. NOT:</ In genere, un trattamento DMSO di 24 ore su 24 h è sufficiente nella maggior parte delle linee umane ESC e iPSC. Le linee cellulari con tassi di crescita molto lenti (lunghi tempi di raddoppio) possono beneficiare dell’incubazione di 48 h con DMSO. Per un’incubazione di 48 h con DMSO, i supporti possono essere sostituiti con supporti con cellule staminali fresche con 1%-2% DMSO dopo i primi 24 h di trattamento. Differenziazione della cultura 3D: Quando le cellule raggiungono una confluenza appropriata, dissociare e raccogliere le cellule in una sospensione cellulare come descritto sopra. Contare le cellule vive utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatico, incluso un marcatore di vitalità. Placcare le cellule in una piastra non rivestita e a basso attaccamento 6 pozzetti a 0,5-1 x 106 cellule per bene in supporti di cellule staminali con 10 inibitori di ROCK. NOT:</ Per le linee cellulari testate nel nostro laboratorio, queste densità in genere hanno portato alla formazione di una sfera hPSC 3D entro 24 h dall’impostazione delle cellule. Permettere alle cellule di incubare per 24 h a 37 gradi centigradi in un’incubatrice di CO2 (5% CO2, atmosfera umida). Preparare 1%-2% DMSO su supporti di cellule staminali preriscaldate (ad es., 100 L di DMSO in 10 mL di media , 1% soluzione DMSO, o 200 DiL di DMSO in 10 mL di media – soluzione DMSO 2%. Sostituire i supporti seguendo le procedure standard (ad es. inclinare la piastra con un angolo di 30-45 gradi per consentire alle sfere cellulari di depositarsi nella parte inferiore del pozzo; trasferire le cellule in un tubo conico sterile e consentire alle sfere cellulari di depositarsi nella parte inferiore del tubo; o raccogliere delicatamente le cellule i n sospensione con una pipetta da 5 o 10 mL in un tubo conico sterile e cellule centrifugate a 300 x g per 5 min a RT). Aspirare i supporti dalle celle e sostituirli con la soluzione DMSO, pipetting delicatamente. Consentire alle cellule di incubare per 24 h a 48 h a 37 gradi centigradi in un’incubatrice di CO2 (5% CO2, atmosfera umida) prima della differenziazione. NOT:</ In genere, un trattamento DMSO di 24 ore su 24 h è sufficiente nella maggior parte delle linee umane ESC e iPSC. Le linee cellulari con tassi di crescita molto lenti (lunghi tempi di raddoppio) possono beneficiare dell’incubazione di 48 h con DMSO. Per un’incubazione di 48 h con DMSO, i supporti possono essere sostituiti con supporti con cellule staminali fresche con 1%-2% DMSO dopo i primi 24 h di trattamento. 3. Differenziazione ai livelli germinali primari NOT:</ Di seguito sono descritti i metodi precedentemente indicati per essere efficaci nel nostro laboratorio per PSC cresciuti in un monostrato su 6 piastre di pozzo. Qualsiasi protocollo di differenziazione scelto deve essere utilizzato dopo il trattamento DMSO per promuovere la differenziazione nei lignaggi desiderati. Rimuovere la soluzione DMSO dopo un trattamento di 24-48 h e procedere con la differenziazione seguendo i protocolli standard. Differenziazione dell’endoderma (adattato da Kroon et al.30) Pretrattare le cellule con DMSO come descritto in precedenza per le colture 2D. Preparare le soluzioni azionarie Wnt3a e Activin A. Preparare i supporti di differenziazione endodermica del giorno 1 aggiungendo Wnt3a a una concentrazione finale di 20 ng/mL e Activin A a una concentrazione finale di 100 ng/mL al volume appropriato di supporti RPMI preriscaldati. Dopo il pretrattamento DMSO, aspirare i supporti dalle cellule e sostituirli con supporti giorno 1 (ad esempio, 2 mL per pozzo di un 6 pozzetti). Permettere alle cellule di incubare per 24 h a 37 gradi centigradi in un’incubatrice di CO2 (5% CO2, atmosfera umida). Preparare i giorni 2 e 3 supporti di differenziazione endodermica aggiungendo Activin A a una concentrazione finale di 100 ng/mL al volume appropriato di supporti RPMI preriscaldati. Aspirare i supporti dalle celle e sostituirli con supporti giorno 2 (ad esempio, 2 mL per pozzo di una piastra di 6 pozzetti). Lasciare che le cellule incubano per 24 h a 37 gradi centigradi in un’incubatrice di CO2 (5% CO2, atmosfera umida). Aspirare i supporti dalle celle e sostituirli con i supporti Giorno 3 (ad esempio, 2 mL per pozzo di un 6 pozzetti). Differenziazione del mesoderma (adattato da .hang et al.31) Pretrattare le cellule con DMSO come descritto in precedenza per le colture 2D. Preparare le soluzioni azionarie Wnt3a e Activin A. Preparare i supporti di differenziazione mesodermica aggiungendo Wnt3a a una concentrazione finale di 20 ng/mL e Activin A ad una concentrazione finale di 100 ng/mL al volume appropriato di supporti RPMI avanzati preriscaldati. Dopo il pretrattamento del DMSO, aspirare i supporti dalle cellule e sostituirli con supporti di differenziazione (ad esempio, 2 mL per pozzo di una piastra 6). Permettere alle cellule di incubare per 24 h a 37 gradi centigradi in un’incubatrice di CO2 (5% CO2, atmosfera umida). Differenziazione dell’ectoderma (adattato da Chambers et al.32) Pretrattare le cellule con DMSO come descritto in precedenza per le colture 2D. Preparare le soluzioni stock Noggin e SB431542. Preparare i supporti di base di differenziazione ectodermica sciogliendo la sostituzione del siero a eliminazione diretta (KOSR) a una concentrazione finale del 10% nel DMEM ad eliminazione diretta. NOT:</ Preparare un numero sufficiente di supporti di base per 3-4 giorni di modifica dei supporti. Preparare i supporti di differenziazione ectodermica aggiungendo Noggin ad una concentrazione finale di 500 ng/mL e SB431542 ad una concentrazione finale di 10 M al volume appropriato di DMEM KOSR/knockout preriscaldato. Dopo il pretrattamento del DMSO, aspirare i supporti dalle cellule e sostituirli con supporti di differenziazione (ad esempio, 2 mL per pozzo di una piastra 6). Lasciare che le cellule incubano per 3-4 giorni a 37 gradi centigradi in un’incubatrice di CO2 (5% CO2, atmosfera umida), sostituendo i media ogni giorno con fattori di differenziazione appena aggiunti. 4. Differenziazione ai tipi di cellule progenitori Di seguito vengono descritti i metodi precedentemente dimostrati efficaci nel nostro laboratorio per PSC cresciuti in una coltura 2D o 3D. Qualsiasi protocollo di differenziazione scelto deve essere utilizzato dopo il trattamento DMSO per promuovere la differenziazione nei lignaggi desiderati. Rimuovere la soluzione DMSO dopo un trattamento di 24-48 h e procedere con la differenziazione seguendo i protocolli standard. Differenziazione delle cellule progenitrici neurali (adattato da Tchieu et al.33) Preparare 6 pozzetti rivestindo con una matrice o substrato ridotto di cellule staminali pluripotenti, secondo le istruzioni del produttore, per almeno 1 h in un’incubatrice di CO2 (5% CO2, atmosfera umida). Le lastre rivestite possono essere avvolte e conservate a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 settimana. Piatto PSC come descritto sopra a densità di 0,5-1 x 106 cellule per bene in supporti di cellule staminali contenenti un inibitore ROCK. Pretrattare le cellule con DMSO come descritto in precedenza per le colture 2D. Preparare piccole soluzioni chimiche inibitori LDN193189, SB431542 e XAV939. Preparare i supporti di differenziazione dei neuroectodermi delle giornate 1-3 integrando Essential 6 Media con 500 nM LDN193189, 10 M SB431542 e 2 XAV939. Dopo il pretrattamento Del DMSO, aspirare i media e sostituire con i media neuroectodermi giorni 1-3 (ad esempio, 2 mL per pozzo di un 6 bene). Cambiare i media ogni giorno. Preparare i giorni 4-12 supporti di differenziazione neuroectodermi integrando Essential 6 Media con 500 nM LDN193189 e 10 SB431542. Il giorno 4 della differenziazione, aspirare i media e sostituire con giorni 4-12 supporti neurodectoderm. Cambiare il supporto ogni giorno. Dopo 12 giorni di differenziazione, le cellule differenziate dovrebbero esprimere marcatori appropriati delle cellule progenitrici neurali (NPC). I PNG possono essere ulteriormente mantenuti in supporti neurali contenenti DMEM/F-12, 2% B-27, 1% N-2, e integrati con 10 fattori di crescita fibroblasti di base (bFGF). Passare i PNG quando confluente utilizzando una soluzione di distacco cellulare, placcatura NPC a 0,5-1 x 106 cellule per bene. Differenziazione delle cellule progenitorioli oligodendrociti (adattato da Douvaras e Fossati34) Piastrare i PSC come descritto sopra ad una densità di 1 x 105 per bene su 6 lastre di pozzo rivestite in supporti di cellule staminali contenenti un inibitore ROCK. Pretrattare le cellule con DMSO come descritto in precedenza per le colture 2D. Preparare SB431542, LDN193189, soluzioni di stock di acido retinoico (RA) e agonista levigato (SAG). Preparare i giorni 0–8 supporti di differenziazione completando DMEM/F-12 con 10 sB431542, 250 nM LDN193189 e 100 nM RA. Dopo il pretrattamento del DMSO, incubare cellule con supporti di differenziazione per 8 giorni, cambiando i media ogni giorno con fattori di differenziazione appena aggiunti (ad esempio, 2 mL per pozzo di una piastra di 6 pozzetti). Il giorno 8, sostituire i supporti con DMEM/F-12 contenente 1x MEM soluzione di aminoacidi non essenziali (NEAA), 1X L-glutamine, 2-mercaptoetanolo, penicillina/streptomicina, e 1x N-2 integrato 100 nM RA e 1 SAG. Cambiare il supporto ogni giorno. Dopo 12 giorni di differenziazione, le cellule differenziate devono esprimere marcatori appropriati delle cellule progenitrici oligodendrocite (OPC). Differenziazione delle cellule progenitori endocrine (adattato da Pagliuca et al.35) PSC di semi a 6 x 105 cellule/mL nei supporti delle cellule staminali più 10 – inibitore ROCK in flaconi da 500 mL posizionati su una piastra di agitazione a 9 posizioni impostata alla velocità di rotazione di 70 giri in un’incubatrice di 37 gradi centigradi, 5% di CO2e 100% di umidità. Consentire ai cluster di depositarsi nella parte inferiore del pallone, aspirare il supporto, quindi pretrattare con 1%-2% DMSO. Preparare Activin A, Chir99021, KGF, Sant1, all-trans retinoic acid (RA), LDN193189, PdBU, XXI, Alk51, T3 e Betacelluin stock soluzioni. Preparare i supporti di base di differenziazione in base alla formulazione nella tabella 3. Dopo il pretrattamento Del DMSO, aspirare i supporti e sostituire con supporti S1 integrati con 100 ng/mL Activin A e 3 mM Chir99021 (ad esempio, 500 mL per fiaschetta). Lasciare l’incubazione per 24 ore. Il giorno 2, sostituire i media con i media S1 integrati con 100 ng/mL Activin A. Consentire l’incubazione per 2 giorni. Il giorno 4, sostituire i supporti con supporti S2 integrati con 50 ng/mL KGF. Lasciare l’incubazione per 3 giorni, cambiando i media dopo i primi 2 giorni (Giorno 6). Il giorno 7, sostituire i supporti con supporti S3 integrati con 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA e 200 nM LDN193189. Lasciare l’incubazione per 24 ore. Il giorno 8, sostituire i supporti con supporti S3 integrati con 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA, 200 nM LDN193189 e 500 nM PdBU. Lasciare l’incubazione per 24 ore. Il giorno 9, sostituire i supporti con supporti S3 integrati con 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1 e 100 nM RA. Consentire l’incubazione per 5 giorni, cambiando i media ogni 2 giorni (giorno 11 e 13). Nei giorni 14 e 16, sostituire i supporti con supporti S5 integrati con 0,25 mM Sant1, 100 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3 e 20 ng/mL betacellulin (4 giorni di incubazione totale). Nei giorni 18 e 20, sostituisci i supporti con supporti S5 integrati con 25 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3 e 20 ng/mL betacellulin. 5. Convalida immunocitochimica della differenziazione NOT:</ I seguenti metodi descrivono un protocollo immunocitochimico generale che può essere regolato in base alle esigenze. Gli anticorpi primari sono quelli che sono stati precedentemente convalidati nel nostro laboratorio. Possono essere utilizzate anche altre tecniche per la convalida della differenziazione (ad esempio, citometria di flusso, qPCR, sequenziamento dell’RNA, gonfiore occidentale, saggi funzionali, ecc.). Cellule di immunoetichettatura Per le colture 3D nelle sospensioni, piastra a grisciolo intero cellulare o cluster dispersi in sospensioni monocellulare su piastre rivestite per 18-24 h prima della fissazione. Aspirati i supporti dalle cellule aderenti e lavati brevemente con PBS a RT su uno shaker. Per la fissazione delle cellule, aspirare PBS e incubare le cellule con 4% paraformaldeide (PFA) in PBS per 20 min a RT su shaker.ATTENZIONE: Lo stock di PFA dovrebbe essere preparato sotto una cappa di fumi a causa della sua tossicità. Non inalare e indossare attrezzature protettive personali adeguate. Rimuovere la PFA e scartare nel contenitore di rifiuti chimici appropriato. Lavare le cellule 3x con PBS per almeno 5 min per lavaggio a RT su uno shaker. Per la permeabilizzazione e il blocco cellulare, incubare le cellule con il siero d’asino del 5% preparato in 0,3% triton-x 100/PBS per 1 h a RT su uno shaker. Preparare la soluzione anticorpale primaria nella stessa soluzione utilizzata per la permeabilizzazione/blocco. Incubare nella soluzione anticorpale primaria durante la notte a 4 gradi centigradi su shaker. Dopo l’incubazione notturna, lavare le cellule 3x con PBS per almeno 5 min per lavaggio a RT su uno shaker. Preparare la soluzione anticorpale secondaria in una soluzione di permeabilizzazione/blocco. Lasciare incubare nella soluzione anticorpale secondaria per 1 h a RT su uno shaker. Soluzione anticorpale secondaria aspirato e lavare le cellule 3x con PBS per almeno 5 min per lavaggio a RT su uno shaker. Incubare cellule con DAPI o un altro marcatore preferito per un tempo di incubazione appropriato e risciacquare in PBS. Quantificazione delle immagini Acquisire un minimo di tre immagini per condizione al microscopio fluorescente e/o con una piattaforma di screening ad alto contenuto. Quantificare la percentuale di cellule positive per ogni marcatore contando il numero totale di cellule colorate degli anticorpi e i numeri di cellule totali (in base alla colorazione dei nuclei DAPI/Hoechst) utilizzando un software di imaging imparziale (ad esempio, ImageJ) o una piattaforma di screening automatizzato per Analisi.