הטיפול הארעי של תאי גזע בעלי עוצמה אנושית עם DMSO כדי לקדם בידול
Summary
יצירת סוגי תאים הבדיל מתאי גזע האדם הרב עוצמה (hPSCs) מחזיק הבטחה טיפולית גדולה אך נשאר מאתגר. PSCs לעתים קרובות מפגין חוסר יכולת מובנית להבדיל גם כאשר מגורה עם קבוצה נאותה של אותות. מתוארים כאן הוא כלי פשוט כדי לשפר בידול רב היוחסין על פני מגוון של קווי PSC.
Abstract
למרות השימוש הגוברת של תאי גזע pluriפוטנטי (PSCs), אתגרים ביעילות מבדילים עובריים ומושרה בתאי גזע pluriפוטנטי (ESCs ו-iPSCs) ברחבי ליננים שונים להישאר. פרוטוקולים רבים של בידול פותחו, אך השונות באמצעות קווי התאים ושיעורי בידול נמוכים להקנות אתגרים בהצלחה יישום פרוטוקולים אלה. המתואר כאן הוא אמצעי קל וזול כדי לשפר את יכולת הבידול של PSCs. זה כבר הוכח כי טיפול בתאי גזע עם ריכוז נמוך של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) מגביר באופן משמעותי את הנטייה של מגוון רחב של PSCs להבדיל בין סוגי תאים שונים לאחר בידול מכוון. טכניקה זו הוכח כעת להיות יעיל על פני מינים שונים (למשל, העכבר, הפרימטים, והאנושי) לתוך מספר רב של הגילאים, החל נוירונים והרורואידים הקליפת הגוף תאים שרירים חלקה והפטציטים. טרום טיפול DMSO משפר PSC בידול על ידי ויסות מחזור התא לקרקע התאים גזע להיות מגיב יותר אותות בידול. בתנאי כאן הוא מתודולוגיה מפורטת לשימוש בכלי זה פשוט כאמצעי הניתן ליישום והחלים נרחב כדי להבדיל ביתר יעילות PSCs לכל השושלת של בחירה.
Introduction
השימוש בתאי גזע פלאוריטי הוביל התקדמויות רבות במחקר ביו, כולל שדות של רפואה רגנרטיבית ו-תא גזע טיפולים מבוססי, דוגמנות מחלות, והקרנת סמים. זה גם הוביל לאפשרות הכללית של מחקר לתרגום יותר ורפואה אישית. הופעתו של תא גזע המושרה pluripotent (iPSC) הטכנולוגיה לפני 20 שנה הרשו לחוקרים לפתח תאים גזע pluriפוטנטי מרקמות סומטיים ולהבדיל אותם לתוך סוגי תאים פונקציונליים ללמוד מגוון של פתווגיות, כולל מחלות לב וכלי דם, נוירולוגיות ואימונולוגיים. למרות צעדים משמעותיים נעשו בטכנולוגיית גזע תא בידול, אתגרים ביעילות מבדילים בתאי גזע האדם העובריים (hESCs) ו iPSCs עדיין להתמיד, הגבלת השימוש הנרחב של הטכנולוגיה תא גזע על פני שונים תוכניות מחקר. השונות הטבועה בין קווי תאים שונים ושיבוטים ממשיכה להציב מכשולים להבדיל קווי גזע התאים הרצוי לינינים1. יתר על כן, הנובעות בוגרת, תאים פונקציונליים מובחנים סופני מ hPSCs נשאר תהליך מייגע ובלתי יעיל על פני ליננים רבים. למעשה, תאים הבדיל מ hPSCs לעתים קרובות להיכשל סופני להבדיל תאים פונקציונליים2. ב הנעה נוספת מבוססי תא גזע טיפולים להשתמש בחולים, יש צורך לשפר ולהבטיח את היעילות של תאים הנוצרים מ hPSCs.
המעבדה שלנו הקימה כלי מהיר, זול כדי לשפר באופן משמעותי את היעילות של ההבחנה הן iPSCs ו ESCs לתוך סוגי תאים בוגרים. מצאנו כי טרום טיפול של hiPSCs ו hESCs עם מאוד נפוץ diמתיל סולפוקסיד (DMSO) עבור 24 h כדי 48 h לפני בימוי תוצאות בידול בשיפור מסומן ביכולת בידול תא גזע. טיפול עם DMSO מגביר את הפרופורציה של hiPSCs ו hESCs בשלב מוקדם G1 של מחזור התא ומפעילה את חלבון retinנובלסטומה (Rb)3, וסת קריטי של התפשטות התא, הישרדות, ובידול4. בעבודה יותר לאחרונה, זה נמצא כי Rb ואת בני משפחתה נדרשים עבור השפעות פרו בידול של DMSO, כגון הפעלה ארעית של Rb מדכאת את ההשפעות של DMSO, בעוד הפעלה חוקתית של Rb באופן ארעי מגביר . ההשפעות של DMSO5 מקביל למחזור התאים במהלך פיתוח עובריים, מחזור התא של escs ו-iPSCs מאופיין בשלב מקוצר של G1 המקדם התחדשות עצמית6,7,8. שלב זה מקוצר G1 מאפשר התפשטות בלתי מוגבלת יותר, אך מגביל את הפוטנציאל לבידול4,9. על-ידי קידום מעצר גדילה ב-G1 והפעלת פקדי מחסום במחזור התא של hESCs ו iPSCs, התאים הראשוניים DMSO הטיפול עבור שינויי הגורל התא בעקבות בידול מכוון.
עד כה, dmso טרום טיפול הוכח לשפר את יכולת הבידול לכל שלוש שכבות הנבט ביותר מ 30 שליטה ומחלות ספציפיים האדם ESC ו ipsc קווי התא3,5 , כמו גם את הבידול של תאי גזע ואחרים קווי תאים למגוון סוגים אחרים של תאים בוגרים במחקרים הבאים10,11,12,13,14,15,16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , מיכל בן 22 , מיכל בן 23 , בת 24 , מיכל בן 25 , מיכל בן 26 , בן 27 , 28 (טבלה 1). יתר על כן, הטיפול dmso הוכח להיות יעיל בשיפור הבידול של תאים ראשוניים לא אנושיים21,23 (למשל, עכבר, פרימטים, ארנב), מציע מנגנונים משותפים על פני מינים. לבסוף, הטיפול הקדם DMSO הורחב גם לטכנולוגיה לעריכת גנים, עם מחקר אחד מסוים מראה כי 24 h DMSO טרום טיפול של hESCs/iPSCs הגדילה באופן משמעותי את היכולת של אשכולות קבועים מקובצים באופן קבוע Interinggspic הקצר (קריספאר) /כריסטין הקשורה חלבון-9 (Cas9)-תיווך עריכת יעילות של DNA שאינו קידוד מבלי לשלב מוטציות לא מכוונות29. בתנאי כאן היא מתודולוגיה מפורטת של טרום הטיפול DMSO של hESCs ו iPSCs עבור יישומים בביולוגיה תא גזע ובידול מכוון.
Protocol
1. תחזוקת תאי גזע הערה: פרוטוקול תחזוקת התאים המתוארים להלן חל על תאי גזע בעלי עוצמה (PSCs) המתוחזקים בתוך מונאולייר חסיד. מדיה, ריאגנטים אחרים, ותרבות התא לוחות המשמשים לפני הטיפול DMSO ניתן לכוונן לפי הצורך. עבור כל הפרוטוקולים הבאים בכתב יד זה, יש לטפל בתאים תחת ארון בטיחות ביולוגי. מעיל סטרילי, 6 ובכן, רקמת התרבות שטופלו לוחות עם תא גזע pluripotent מטריצה או מצע מוכן להוראות היצרן ו-דגירה עבור לפחות 1 h ב חממה2 (5% co2, אווירה לח). לוחות מצופים ניתן לעטוף בסרט ולאחסן ב -4 ° c עד שבוע אחד. הפשרת cryopreserved שמורות באמבט מים ב37 ° c. לחטא בקבוקון עם אתנול לפני מבוא הקבינט בטיחות ביולוגית, ולאחר מכן מיד להעביר את התאים על ידי ליטוף לצינור חרוט סטרילי המכיל 5-10 כרכים של מדיה תא גזע מראש. צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). מנושף את התקשורת ומחדש בעדינות את הגלולה תא 1 מ ל של מדיה תא גזע בתוספת 10 μM סלע מעכב, כגון Y-27632. מוחלק את מטריצת התרבות מן הצלחת ואת הזרע את התאים בצפיפות הרצויה, בדרך כלל 0.5-1 x 106 תאים לכל טוב לפחות 2 מ ל של מדיה תא גזע לכל טוב.הערה: צפיפות הציפוי יכולה להשתנות על-פני קווי תאים שונים, ושיבוטים ולהיות ממוטבים בהתאם. שמור על התאים על ידי החלפת מדיה תא גזע מראש מדי יום. פצל את התאים בערך 70%-80% השטף או כאשר מושבות התא מתחילות ליצור קשר. עבור מפצל תאים, מטפי את התקשורת ולשטוף את התאים פעם אחת עם הערוץ מעוקר. מודיית את התאים עם 1 מ ל של הפתרון האנזים דיסוציאציה לכל טוב עבור 5-10 דקות ב 37 ° c. לשטוף ולהשעות מחדש את התאים עם מדיה תא גזע מראש ולהעביר לצינור חרוט סטרילי עם 5-10 כרכים של מדיה תא גזע. בצע את שלבים 1.3-1.7 כדי לוחית את התאים. 2. DMSO טרום טיפול הערה: בעת ציפוי תאים עבור DMSO טרום טיפול לפני בידול, צפיפות התא התחלתי ציפוי צריך להיות ממוטב עם התחשבות שיעור הצמיחה אופייני של קו הגזע, כמו גם את הפרוטוקול בידול בשימוש. לאמת את העוצמה באמצעות סמנים קונבנציונליים, לפי הצורך. תאים צריכים להיות מיושנים לפחות 1x-2x אחרי הפשרה הראשונית לפני בידול. בידול תרבות דו-ממדית כאשר התאים מגיעים לשטף מתאים, מכינים צלחות מצופות, מנתק את התאים ומכינים השעיית תא בודד כמתואר לעיל. ספור את התאים החיים באמצעות מונה תאי הומוציטוטומטר או התאים האוטומטיים, כולל טרי, כחול או סימן הכדאיות אחר. צלחת התאים על מצופה 6 צלחת הבאר ב 0.5-1 x 106 תאים לכל טוב במדיה תא גזע עם 10 ΜM סלע מעכב.הערה: עבור קווי התא נבדק במעבדה שלנו, צפיפויות אלה בדרך כלל הביאו 80%-90% תאים confluent בתוך 24 h DMSO טרום טיפול. אפשר לתאי הדגירה של 24 שעות ב 37 ° c בחממה של CO2 (5% ושות2, אווירה לח). הכן 1%-2% DMSO ב מדיה תא גזע מראש (למשל, 100 μL של DMSO ב 10 מ ל של מדיה = 1% DMSO פתרון, או 200 μL DMSO ב 10 mL של מדיה = 2% DMSO פתרון). לאחר 24 שעות דגירה, לאכול את התקשורת מתאים ולהחליף אותו עם פתרון DMSO. אפשר את התאים כדי להדגירה 24 שעות עד 48 h ב 37 ° c בחממה CO2 (5% co2, אווירה לח) לפני בידול.הערה: בדרך כלל, טיפול 24 h DMSO הוא מספיק על פני רוב של האדם ESC ו iPSC קווים. קווי תאים עם שיעורי צמיחה איטית מאוד (זמני הכפלה ארוכה) יכולים להפיק תועלת מהדגירה 48 h עם DMSO. עבור דגירה 48 h עם DMSO, מדיה ניתן להחליף עם מדיה תא גזע טרי עם 1%-2% DMSO לאחר 24 הטיפול הראשון. בידול תרבות תלת-ממדית: כאשר התאים מגיעים לשטף מתאים, הנתק ולאסוף את התאים בהשעיה תא כפי שמתואר לעיל. ספור את התאים החיים באמצעות מונה תאי הומוציטוטומטר או תא אוטומטי כולל סמן יכולת הכדאיות. צלחת התאים בתוך מצופה, נמוך מצורף 6 צלחת לוחית ב 0.5-1 x 106 תאים לכל טוב במדיה תא גזע עם 10 ΜM סלע מעכב.הערה: עבור קווי התא נבדק במעבדה שלנו, צפיפויות אלה בדרך כלל הביאו היווצרות כדור hPSC 3D בתוך 24 h של הגדרת תאים. אפשר לתאי הדגירה של 24 שעות ב 37 ° c בחממה של CO2 (5% ושות2, אווירה לח). הכן 1%-2% DMSO ב מדיה תאי גזע מראש (למשל, 100 μL של DMSO ב 10 מ ל של מדיה = 1% DMSO פתרון, או 200 μL של DMSO ב 10 מ ל של מדיה = 2% DMSO פתרון). החלף את המדיה הבאה לאחר ההליכים הסטנדרטיים (למשל, הטה את הצלחת בזווית של 30 °-45 ° כדי לאפשר לספירות תאים להתיישב בתחתית הבאר; העבר תאים לצינורית חרוט סטרילית ואפשר כדוריות תאים להתיישב בתחתית הצינור; או לאסוף בעדינות את התאים n ההשעיה באמצעות הצינורות 5 או 10 מ”ל לתוך צינור חרוט סטרילי ותאי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב RT). מפתי את המדיה מתאים ומחליפים אותו בתמיסה DMSO, מלטף בעדינות. אפשר לתאים להדגירה 24 שעות עד 48 h ב-37 ° צ’ בחממה של CO2 (5% co2, אווירה לח) לפני בידול.הערה: בדרך כלל, טיפול 24 h DMSO הוא מספיק על פני רוב של האדם ESC ו iPSC קווים. קווי תאים עם שיעורי צמיחה איטית מאוד (זמני הכפלה ארוכה) יכולים להפיק תועלת מהדגירה 48 h עם DMSO. עבור דגירה 48 h עם DMSO, מדיה ניתן להחליף עם מדיה תא גזע טרי עם 1%-2% DMSO לאחר 24 הטיפול הראשון. 3. בידול שכבות הנבט הראשי הערה: השיטות הבאות מתוארות כיעילות במעבדה שלנו עבור PSCs גדל במונאולייר על 6 צלחות היטב. יש להשתמש בכל אחד מפרוטוקולי הבידול של הבחירה לאחר טיפול DMSO כדי לקדם בידול לתוך הדורות הרצויים. הסר פתרון DMSO לאחר טיפול 24-48 h ולהמשיך עם בידול בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים. בידול אנדועור (מותאם מקרון ואח ’30) טיפול מקדים בתאים עם DMSO כפי שמתואר לעיל עבור תרבויות דו-ממדיות. הכינו Wnt3a ופעילות לפתרונות מניות. הכנת יום 1 מדיה בידול הגוף על ידי הוספת Wnt3a לריכוז הסופי של 20 ng/mL ו-הפעילות לריכוז הסופי של 100 ng/mL לנפח המתאים של מדיה RPMI prewarmed. לאחר DMSO הטיפול הקדם, מחלק מדיה מן התאים ולהחליף אותו עם יום 1 מדיה (למשל, 2 מ ל בבאר של 6 היטב צלחת). אפשר לתאי הדגירה של 24 שעות ב 37 ° c בחממה של CO2 (5% ושות2, אווירה לח). הכנת ימים 2 ו-3 מדיה בידול העורי על ידי הוספת הפעילות לריכוז הסופי של 100 ng/mL לנפח המתאים של מדיה prewarmed RPMI. מחלק מדיה מהתאים ומחליפים אותו במדיה של יום 2 (לדוגמה, 2 מ”ל לכל היותר בצלחת של 6 מיל). הניחו לתאים לעבור למשך 24 שעות ב-37 ° c בחממה של CO2 (5% קו2, אווירה לח). מחלק מהתקשורת מהתאים ומחליפים את המדיה ביום 3 (לדוגמה, 2 מ”ל לכל היותר בצלחת של 6 מיל). בידול מזועור (מותאם מז ואח ’31) טיפול מקדים בתאים עם DMSO כפי שמתואר לעיל עבור תרבויות דו-ממדיות. הכינו Wnt3a ופעילות לפתרונות מניות. הכנת מדיה בידול מזועורי על-ידי הוספת Wnt3a לריכוז הסופי של 20 ng/mL ופעילות A עד לריכוז הסופי של 100 ng/mL לנפח המתאים של מדיית RPMI מתקדמת. לאחר DMSO הטיפול הקדם, מוחלק מדיה מתאים ולהחליף עם בידול מדיה (למשל, 2 מ”ל לכל טוב של 6 היטב צלחת). אפשר לתאי הדגירה של 24 שעות ב 37 ° c בחממה של CO2 (5% ושות2, אווירה לח). בידול בעור (מותאם32ללשכה ואח ‘) טיפול מקדים בתאים עם DMSO כפי שמתואר לעיל עבור תרבויות דו-ממדיות. הכינו את הפתרונות של מניות SB431542. הכינו מדיה בסיס המאקל על ידי החלפת סרום הסתרה (KOSR) לריכוז סופי של 10% בנוקאאוט DMEM.הערה: הכן מספיק מדיית בסיס עבור 3-4 ימים של שינוי מדיה. הכינו מדיה בידול הגוף על ידי הוספת ראש לריכוז הסופי של 500 ng/mL ו SB431542 לריכוז הסופי של 10 μM לנפח המתאים של prewarmed KOSR/נוקאאוט DMEM. לאחר DMSO הטיפול הקדם, מוחלק מדיה מתאים ולהחליף עם בידול מדיה (למשל, 2 מ”ל לכל טוב של 6 היטב צלחת). אפשר לתאים כדי לעבור 3-4 ימים ב 37 ° c בחממה2 % (5% co2, אווירה לח), החלפת מדיה מדי יום עם גורמי בידול הוסיף טרי. 4. בידול לסוגי תאים מחולל קדמון להלן תיאור שיטות שהוצג בעבר להיות יעיל במעבדה שלנו עבור PSCs גדל בתרבויות 2D או 3D. יש להשתמש בכל אחד מפרוטוקולי הבידול של הבחירה לאחר טיפול DMSO כדי לקדם בידול לתוך הדורות הרצויים. הסר פתרון DMSO לאחר טיפול 24-48 h ולהמשיך עם בידול בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים. בידול תא מקדמון עצבי (מותאם מצ ואח ’33) להכין 6 לוחות היטב על ידי ציפוי עם תא גזע pluripotent מוסמך הצמיחה מופחתת מטריצה או מצע, לפי הוראות היצרן, עבור לפחות 1 h ב חממה2 שכונתיות (5% CO2, אווירה לח). לוחות מצופים ניתן לעטוף בסרט ולאחסן ב -4 ° c עד שבוע אחד. צלחת PSCs כמתואר לעיל בצפיפות של 0.5-1 x 106 תאים לכל טוב במדיה תא גזע המכיל מעכב רוק. טיפול מקדים בתאים עם DMSO כפי שמתואר לעיל עבור תרבויות דו-ממדיות. הכנת מעכבי כימיים קטנים LDN193189, SB431542, ו XAV939 מניות פתרונות. להכין ימים 1-3 בידול neuroectoderm על ידי להשלים את התקשורת האתריים 6 עם 500 nM LDN193189, 10 μM SB431542, ו-2 μM XAV939. לאחר הטיפול הטרום DMSO, מוזים את התקשורת ולהחליף עם ימים 1-3 מדיה neuroectoderm (g., 2 מ”ל לכל טוב של 6 היטב צלחת). שינוי מדיה מדי יום. הכנת ימים 4-12 מדיה בידול neuroectoderm על ידי להשלים את Essential 6 מדיה עם 500 nM LDN193189 ו 10 μM SB431542. ביום 4 של בידול, מרעיף את התקשורת ומחליפים עם ימים 4-12 מדיה נוירודקטותיעור. שנה את המדיה מדי יום. לאחר 12 ימים של בידול, תאים הבדיל צריך לבטא סמנים מתאימים של תאים מחולל קדמון (NPCs). NPCs ניתן לשמור נוספת במדיה העצבית המכילה DMEM/F-12, 2% B-27, 1% N-2, ובתוספת עם 10 μg/mL בסיסי הצמיחה פיברומגרם (bFGF). מעבר NPCs כאשר באמצעות פתרון התנתקות התא, ציפוי NPCs ב 0.5-1 x 106 תאים לכל טוב. אוליגודנדרוציטים מחולל בידול בתאים (מותאם מדואראס ומFossati34) צלחת PSCs כפי שמתואר לעיל בצפיפות של 1 x 105 לכל טוב על מצופה 6 צלחות היטב במדיה תא גזע המכיל מעכב רוק. טיפול מקדים בתאים עם DMSO כפי שמתואר לעיל עבור תרבויות דו-ממדיות. הכן SB431542, LDN193189, חומצה retinoic כל טרנס (RA), ו smoothened אגוניסט (מניות) פתרונות. להכין ימים 0 – 8 בידול מדיה על ידי הגדלת DMEM/F-12 עם 10 μM SB431542, 250 nM LDN193189, ו 100 ננומטר RA. לאחר DMSO טרום טיפול, בתאי הדגירה עם מדיה בידול במשך 8 ימים, שינוי מדיה מדי יום עם גורמי בידול הוסיף טרי (למשל, 2 מ ל לכל טוב של 6 היטב צלחת). ביום 8, החלף את המדיה באמצעות DMEM/F-12 המכילים חומצות אמינו שאינן חיוניות של 1x (NEAA), 1 x-גלוטמין, 2-mercaptoethanol, פניצילין/סטרפטומיצין, ו-1x N-2 בתוספת 100 ננומטר RA 1 μM. שנה את המדיה מדי יום. לאחר 12 ימים של בידול, התאים הבדיל צריך לבטא סמנים מתאימים של תאים אוליגודנדרוציטים קדמון (OPCs). בידול תא מחולל קדמון אנדוקרינית (מותאם לפאגגלוטי ואח ‘.35) Seed PSCs במהירות 6 x 105 תאים/mL בתקשורת תא גזע ועוד 10 ΜM סלע מעכבי ב 500 mL טווה מבחנות ממוקם על מהומה 9-מיקום צלחת להגדיר בקצב הסיבוב של 70 rpm בחממה 37 ° c, 5% CO2, ו 100% לחות. אפשר לאשכולות להתיישב בתחתית הבקבוקון, לאחד את המדיה, ואז לטפל מראש עם 1%-2% DMSO. להכין פעילות A, Chir99021, KGF, Sant1, חומצה retinoic כל טרנס (RA), LDN193189, PdBU, XXI, Alk51, T3, ו Betacelluin מניות פתרונות. הכנת בידול התקשורת בסיס מבוסס על ניסוח בטבלה 3. לאחר DMSO הטיפול הטרום, מקבל מדיה ולהחליף עם S1 מדיה בתוספת 100 ng/mL פעילות A ו 3 מ”מ Chir99021 (g., 500 mL לבקבוקון). אפשר דגירה של 24 שעות. ביום 2, להחליף מדיה עם S1 מדיה בתוספת 100 ng/mL פעילות A. אפשר דגירה של יומיים. ביום 4, להחליף מדיה עם S2 מדיה בתוספת עם 50 ng/mL KGF. אפשר דגירה של 3 ימים, שינוי מדיה לאחר 2 הימים הראשונים (יום 6). ביום 7, להחליף מדיה עם S3 מדיה בתוספת 50 ng/mL KGF, 0.25 mM Sant1, 2 מ”מ RA, ו 200 nM LDN193189. אפשר דגירה של 24 שעות. ביום 8, להחליף את המדיה עם S3 מדיה בתוספת 50 ng/mL KGF, 0.25 mM Sant1, 2 מ”מ RA, 200 nM LDN193189, ו מ500 ב-nM PdBU. אפשר דגירה של 24 שעות. ביום 9, להחליף מדיה עם S3 מדיה בתוספת 50 ng/mL KGF, 0.25 mM Sant1, ו 100 ננומטר RA. אפשר דגירה של 5 ימים, החלפת מדיה כל יומיים (יום 11 ו -13). בימים 14 ו -16, להחליף מדיה עם S5 מדיה בתוספת עם 0.25 mM Sant1, 100 nM RA, 1 מ”מ XXI, 10 מ”מ Alk5i II, 1 מ”מ T3, ו 20 ng/mL betacellulin (4 ימים הדגירה הכוללת). בימים 18 ו 20, להחליף מדיה עם S5 מדיה בתוספת עם 25 ננומטר RA, 1 מ”מ XXI, 10 מ”מ Alk5i II, 1 מ”מ T3, ו 20 ng/mL betacellulin. 5. ואלידציה של בידול באמצעות אימונוציטוטוזאור הערה: השיטות הבאות מתארות פרוטוקול אימונוציטוטוכימי כללי שניתן להתאימו לפי הצורך. נוגדנים ראשוניים הם אלה שאומתו בעבר במעבדה שלנו. טכניקות אחרות עבור אימות של בידול יכול לשמש גם (למשל, הזרמת הזרימה, qPCR, רצפי RNA, בלוק מערבי, מאמר פונקציונלי, וכו ‘). בתאי אימונוולבלינג עבור תרבויות תלת-ממד בהשעיה, הלוח כולו אשכולות תא או אשכולות התפזרו לתוך תא יחיד השעיה על לוחות מצופה עבור 18-24 h לפני קיבעון. שטפי מדיה מתאים חסיד ולשטוף בקצרה עם PBS ב RT על שייקר. עבור קיבוע התא, מואכל את התאים PBS ו-דגירה עם 4% פאראפורמלדהיד (בשיא) ב PBS עבור 20 דקות ב RT על שייקר.זהירות: המניה צריכה להיות מוכנה מתחת למכסה המנוע בשל הרעילות שלה. אין לשאוף וללבוש ציוד הגנה אישי מתאים. להסיר את הכדורגלן ולהשליך את המכולה המתאימה לפסולת כימית. לשטוף את התאים 3x עם PBS עבור לפחות 5 דקות לשטוף ב RT על שייקר. עבור חדירות התא חסימה, התאים דגירה עם 5% החמור סרום מוכן 0.3% טריטון-x 100/PBS עבור 1 h ב RT על שייקר. הכינו פתרון נוגדן ראשי באותו פתרון המשמש לחדירות/חסימה. מודטה בפתרון הנוגדן העיקרי לילה ב 4 ° c על שייקר. לאחר דגירה לילה, לשטוף את התאים 3x עם PBS עבור לפחות 5 דקות לשטוף ב RT על שייקר. הכינו פתרון נוגדן משני בפתרון חדירות/חסימה. לאפשר דגירה בפתרון נוגדן משני עבור 1 h ב RT על שייקר. מנושף פתרון נוגדן משני ולשטוף תאים 3x עם PBS עבור לפחות 5 דקות לכביסה ב RT על שייקר. דגירה תאים עם DAPI או סמן מועדף אחר לזמן הדגירה המתאים, ולשטוף ב-PBS. קוונפיקציה של תמונה לרכוש מינימום של שלוש תמונות לכל תנאי על מיקרוסקופ פלורסנט ו/או עם פלטפורמת ההקרנה של תוכן גבוה. לכמת את אחוז התאים החיוביים עבור כל סמן על-ידי ספירת המספר הכולל של תאים ויטראז ‘ ומספרי תאים מוחלטים (בהתבסס על מכתמים של הגרעין DAPI/Hoechst) באמצעות תוכנת דימות משוחדת (לדוגמה, ImageJ) או פלטפורמת סינון אוטומטית עבור ניתוחים.
Representative Results
מורפולוגיה של DMSO התייחסו iPSCsהאדם iPSCs נגזר הנושאים שליטה היו מתורבתים או במונאולייר 2D חסיד או בתחומי תא תלת-ממד בהשעיה. כ 24 שעות לאחר ציפוי ראשוני, התאים טופלו עם אחד 1% או 2% DMSO עבור 24 h במדיום תחזוקה. נציג תמונות ברייטפילד לאחר טיפול DMSO מוצגים באיור 1. בהתאם לדיווחים הקודמים עבור iPSCs שנשמר במונאולייר3, dmso טרום טיפול הביא ירידה במינון ארעי תלוי בשיעור הצמיחה לעומת התאים שאינם dmso מטופלים (איור 1א). התפשטות זו משויכת לעלייה באיש הקשר לתא אל התא, אשר מבוטא במיוחד ב 2% DMSO מטופלים תאים המציגים היווצרות מוגברת של מושבות תאים מקובצים באשכולות יותר. בסוגים אחרים של תאים, מעצר DMSO-המושרה G1 הוכח להיות משויך עם ביטוי מוגבר של חלבונים המעורבים אינטראקציות תא תא התומכות בעיכוב המושרה מעצר גדילה36. ב iPSCs שמרו כתחומי תא תלת-ממדיים, הטיפול DMSO הגדיל באופן דומה את מספר כדורי התאים (איור 1B). יתר על כן, טיפול DMSO גם הביא פחות משתנה בגדלים 3D כדור, אשר הוכח בעבר להיות מעיד על קיבולת בידול משופר של התאים37. חשוב מכך, לא 1% או 2% DMSO הביא לרעילות תאים, כפי שנמדד על ידי ספירות הכדאיות (n = 3; 2D תרבות% חיים = שליטה: 80 ± 1.3; 1% DMSO: 82 ± 3.7, 2%: 81 ± 2.7; 3D התרבות% live = שליטה: 81 ± 4.3; 1% DMSO: 82 ± 6.7, 2%: 82 ± 2.7). בסך הכל, תוצאות אלה הן עקביות עם הרעיון כי הטיפול DMSO משנה את מחזור התא דפוסי הצמיחה בתאי גזע תרבותי. השפעות אלה על עיכוב הגדילה הם הפיך כאשר DMSO מוסר מן המדיום, כפי שהוצג בעבר3. טיפול DMSO משפר את הבידול של ESCs לשכבות הנבט הראשיHUES6 hESCs הופרה על צלחות מצופות 24 שעות ואחריו טיפול עם 2% DMSO עבור 24 h במדיום תחזוקה. תאים הובלו לתוך שלוש שכבות הנבט הראשיות בעקבות הטיפול בתבניות המוצגות באיור 2A30,31,32. תאים הבדיל היו אז תוקנו ומוכתם לוגית לסמנים פרוטותמית של כל שכבת נבט בהתאמה (SOX17 עבור אנדועור, ברכירים עבור מזועור, ו SOX1 עבור ectoderm). כפי שמוצג באיור 2B, 24 h של טרום טיפול עם 2% dmso גדל את הפרופורציה של תאים המבטאים כל סמן שכבת נבט בהתאמה. זה עקבי עם הדיווחים הקודמים מהמעבדה שלנו מראה מוגברת הפעילות החיסונית, ביטוי גנטי, כמו גם מספר מוחלט של תאים הבדיל לקראת כל שכבות הנבט בתאי גזע שטופלו dmso3,5. HUES6 הוא קו hESC עם נטייה נמוכה מאוד לבידול בכל שורות הזמן1, ובכל זאת הטיפול dmso משפר באופן משמעותי את יכולתו להבדיל בכל שכבות הנבט. טיפול DMSO משפר את הבידול לסוגי תאים מחולל קדמוןכדי לחקור את ההשפעה של DMSO על בידול לסוגי תא של מערכת העצבים, iPSCs האדם הובחנה לתאי קדמון עצביים (NPCs) או אוליגודנדרוציטים בתאי הקדמון (OPCs). כדי ליצור NPCs, תאים טופלו מראש עם 2% DMSO עבור 24 h במדיום תחזוקה ואחריו 12 ימים של בידול בבימויו33 (איור 3א). כפי שמוצג באיור 3B, 2% dmso טרום טיפול הגדילה את הביטוי של NPC סמן PAX6 לעומת שליטה. שימוש בפרוטוקול אחר שאומת בעבר34 (איור 3ג), iPSCs במשך 12 יום ל-opcs. דומה npcs, opcs נגזר iPSCs וללות עם 2% dmso עבור 24 הפגינו הגדלת הפרופורציה של התאים ביטוי opcs סמנים OLIG2 (איור 3ד). הטיפול הראשוני DMSO ממשיך לשפר את הבידול לתוך סוגי תאים בוגריםכדי לחקור את ההשפעה של DMSO על בשלבים האחרונים של פרוטוקול בידול, HUES8 hESCs היו מטופלים עבור 24 שעות עם 2% DMSO לפני בידול לתאים β בעקבות 20 יום מונחה פרוטוקול בידול המתואר באיור 4a 35. HUES8 שימשו כפי שהם הוכחו בעבר יש נטייה גבוהה יותר לכיוון השושלת האנדובית1,38. בשלב הקבוע ביותר של עור, התאים הבדיל לבטא SOX17 ו FOXA2, מסופי אנדועור (DE) סמנים ספציפיים. עם בידול נוסף לתוך ושלתי הלבלב (PP1) הבמה, הבדיל תאים PDX1 ו FOXA2, סמנים אופייני לתאי מחולל הלבלב. בשלבים אלה של בידול תא הלבלב, את היעילות של אינדוקציה לתוך DE ולאחר מכן לתוך PP1 היו גבוהים עבור שליטה שניהם dmso-מטופלים hESCs הבדיל לתוך כל שלבים אלה (איור 4B, שלבים 1 ו 3). למרות קו התא HUES8 כבר ציין יש נטייה מוגברת כדי להבדיל לתוך השושלת האנדובית, כמו בידול הוא המושרה עוד לתוך סוגי התא מיוחדים יותר בשלבים הטרמינל הhESCs DMSO מטופלים הרבה יותר עשוי לייצר בוגרת תאים האנדוקרינית הלבלב. היעילות של יצירת PDX1/NKX 6.1 + מחולל כדוריות הלבלב, Neurogenin 3 + תאים אנדוקריניים, ו NKX 6.1/C-פפטיד + SC-β תאים היו גבוהים באופן משמעותי ב-DMSO-מטופלים hESCs (איור 4B, שלבים 4 ו-5). תוצאות אלה הן בקנה אחד עם NPC ו OPC בידול מראה כי DMSO משפר את הפוטנציאל בידול לסוגי תאים מחולל קדמון וגם מוכיח כי ההשפעה של DMSO הוא מתמשך ביצירת סוגי תאים מיוחדים יותר. זה עקבי עם העבודה הקודמת, שם הראינו כי הראשונית 24 h dmso הטיפול מגביר את הבידול לתוך סוגי תא מסופים על פני שכבות נבט, כולל לתוך תאים עצביים, כמו גם הכאת קרדיוציטים31,39 בקווי התא עם נטיות גבוה או עני לבידול3. הטיפול הראשוני DMSO משפר את פונקציית התא הנגזר hESC בעקבות השתלת vivoבעבר, הדגמנו את האפקטיביות של טיפול DMSO בשיפור הבידול של hESCs לתוך תאי מחולל הלבלב פונקציונלי מאוחר יותר להראות שיפור מסומן הפרשת אינסולין ב vivo3. שימוש בפרוטוקולים שפורסמו בעבר3,30,40, HUES8 hESCs טופלו עם 1% dmso עבור 24 h, הבדיל לתוך תאים מחולל הלבלב, ו מושתלים לתוך החיסונית scid-בז ‘ להעריך פונקציונליות (למשל, הפרשת אינסולין בתגובה לאתגר גלוקוז או לגירוי KCl) (איור 5א). בעוד היעילות של הבידול לתוך FOXA2 + (~ 90%) ו-PDX1 + (~ 75%) ושלתי הלבלב היו דומים בין השליטה DMSO מטופלים hESCs (איור 5B) עבור הקו HUES8 hesc, התאים הבדיל בין hESCs בעקבות 24 h 1% dmso הטיפול השתפר התגובה לגלוקוז ו kcl גירוי בעקבות השתלת vivo. שיפורים בפונקציונליות היו ברור בתוך 2 שבועות לאחר ההשתלה (איור 5ג) והתעקש לפחות 16 שבועות לאחר ההשתלה (איור 5ד). ביחד, תוצאות אלה מצביעים על כך pretreatment טרום טיפול לא רק מגביר את היעילות בידול לשכבות נבט, בתאי מחולל, וסוגי תאים בוגרים יותר, אבל גם כי הוא ממשיך לשפר את הפונקציונליות של התאים הבדיל ב vivo. סוג תא מובחנים מתחיל סוג תא % DMSO אורך של טיפול DMSO אורך של טיפול DMSO תאי הכבד ESCקו הטלפון של הפאגומהESCESCתאי גזע מסנמצ’אלiPSCsESCESCקו הטלפון של הפאגומהESC 1.01.01.00.50.1-2.01.01.00.51.00.6 8 ימיםמספר ימיםשבעה ימים10-14 ימים7-21 ימיםשבעה ימים4 ימיםחמישה ימים2-21 ימיםברחבי בסמה ואח ‘, 2008קנבראט ואנדרסון, 2008חציר ואח ‘, 2009דואן ואח ‘, 2010לשבח ואח ‘, 2014Kondo ואח ‘, 2014סקולניניק ואח ‘, 2014שוויץ ואח ‘, 2015ניקולאמו ואח ‘, 2016ואנהוב ואח ‘, 2016 שכבות הנבט הראשיות ESCs ו-iPSCsהייסקהייסק 0.1-2.00.50.1-2.0 . עשרים וארבע שעות. עשרים וארבע שעות. עשרים וארבע שעות צ’שטי ואח ‘, 2013צ’שטי ואח ‘, 2015לי ואח ‘, 2018 תאי לב ESCs ו-iPSCsתאים P19ESCs ו-iPSCsכדוריות הגזע העוברי 0.1-2.01.01.0-2.00.8-1.0 . עשרים וארבע שעות4 ימים24-30 שעות. עשרים וארבע שעות צ’שטי ואח ‘, 2013צ’וי ואח ‘, 2014ואן דן ברג ואח ‘, 2016דנג ואח אל, 2017 הלבלב תאים ESCs ו-iPSCsהייסק 0.1-2.00.5 . עשרים וארבע שעות. עשרים וארבע שעות צ’שטי ואח ‘, 2013צ’שטי ואח ‘, 2015 תאים שרירים חלקים תאים P19 1.0 4 ימים צ’וי ואח ‘, 2014 תאים אנדותל תאים P19 1.0 4 ימים צ’וי ואח ‘, 2014 בנוציטים iPSCs 0-1.6 4 ימים Ogaki et al, 2015 אפיתל המעי iPSCs 0-1.6 4 ימים Ogaki et al, 2015 תאים עצביים מרמוסט iPSC 0.05-2.0 . עשרים וארבע שעות Qiu et al, 2015 נויטרופילים קו התאים של לוקמיה 1.25 6-8 ימים טאימורינה ומודלו, 2016 מיופופרות השלד iPSCs 1.5 . עשרים וארבע שעות שוורץ ואח ‘, 2016 אורגנואיד hiPSCs 1.0 . עשרים וארבע שעות יון ואח ‘, 2018 טבלה 1: סיכום העבודה שפורסמה בעבר להפגין את ההשפעות המועילה של טיפול DMSO על בידול. S1 S2 S3 S5 MCDB131 (L) 1 1 1 1 גלוקוז (גר’) 0.44 0.44 0.44 3.6 NaHCO3 (גר’) 2.46 1.23 1.23 1.754 FAF-BSA (גר’) 20 20 20 20 שלה-X (mL) 0.02 0.02 מיכל 5 מיכל 5 גלוטמקס (mL) 10 10 10 10 ויטמין C (מ ג) 44 44 44 44 הפארין (מ ג) 0 0 0 10 P/S (mL) 10 10 10 10 שולחן 2: רכיבי התא האנדוקרינית מחולל מדיום בסיס. איור 1 : הטיפול Dmso משנה את התפתחותם של hPSCs. (א) הנציג ברייטפילד תמונות של hiPSCs מצופה במונאולייר לאחר קבלת שום טיפול (בקרה) או טיפול עם 1% או 2% dmso עבור 24 h. DMSO מקדם את עיכוב זמני הצמיחה תלויי מינון ארעי של iPSCs. (ב) נציג ברייטפילד תמונות של hiPSCs מצופה על לוחות מצורף נמוך כדי לאפשר היווצרות כדור תלת-ממד לאחר קבלת שום טיפול (שליטה) או טיפול עם 1% או 2% dmso עבור 24 h. dmso תוצאות הטיפול משתנה פחות כדור תלת-ממד המערך בהשוואה לשליטה. סרגל קנה מידה = 500 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2 : הטיפול Dmso משפר את הבידול של hPSCs לשכבות הנבט הראשי. (א) סכמטי של פרוטוקולי בידול המשמשים להפקת שלוש שכבות הנבט הראשיות. (ב) תמונות מייצגות של הבדיל HUES6 hESCs immunolabeled SOX17 (העור), ברכוריה (מזועור), ו SOX1 (כעור). טיפול מקדים עם 2% DMSO עבור 24 h הגביר את יעילות הבידול בכל שלוש שכבות הנבט. אחוזים של תאים המבדילים לתוך SOX17 + העור, Brachyury (Brachy) + מזועורי, או SOX1 + תאים ectodermal עור בעקבות בידול מופנה לכל שכבת הנבט של שליטה ו DMSO-מטופלים hESCs הם ציינו עם SEM של שלושה משכפל ביולוגי . מבחן t הניתן לשיוך: אנדועור p = 0.0003; מזועור p = 0.047; מיכל עור p = 0.015. סרגל קנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3 : טיפול Dmso משפר את הבידול לסוגי תא מחולל קדמון. (א) סכמטי של פרוטוקול בידול המשמש להפקת תאים מחולל קדמון (npcs). (ב) תמונות מייצגות של iPSCs האדם הבדיל לתוך npcs אימונויניום עבור Pax6. 24 שעות של טיפול מקדים עם 2% DMSO הגדילה את מספר PAX6 תאים חיוביים. אחוזים של תאים המבדילים לתוך Pax6 + NPCs בעקבות הבידול בבימויו של השליטה ו-DMSO התייחס האדם iPSCs הם ציינו עם SEM של שלושה משכפל ביולוגי. לא מזווג t-test: p = 0.0225. סרגל קנה מידה = 200 μm. (C) סכמטי של פרוטוקול בידול המשמש להפקת תאים אוליגודנדרוציטים קדמון (opcs). (ד) תמונות מייצגות של iPSCs אנושיים הבדיל לתוך אימונוcs החיסונית של סמנים Olig2. 24 שעות של טיפול מקדים עם 2% DMSO הגדילו את הביטוי של שני סמני OPC בהשוואה לשליטה. אחוזים של תאים המבדילים לתוך Olig2 + OPCs בעקבות הבידול המכוון של שליטה ו-DMSO התייחסו iPSCs האדם הם עם SEM של ארבעה משכפל ביולוגי. לא מזווג t-test: p = 0.0466. סרגל קנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4 : הטיפול Dmso משפר את הפוטנציאל בידול הטרמינל של hPSCs. (A) סכימטי של ~ 20 יום בבימויו של הבידול HUES8 hESCs לתוך התאים האנדוקרינית הלבלב הבדיל. (ב) חיסוני לסמנים שצוינו בכל שלב של בידול בעקבות הבידול בבימויו של תאים בקרה ללא טיפול ותאים שטופלו מראש עם 2% dmso עבור 24 h. הטיפול הראשוני DMSO ממשיך להגדיל את הבידול לתוך סוגי תאים האנדוקרינית מסוף בשלבים האחרונים של בידול מופנה. אחוזי התאים המבדילים בין הסמנים המצוינים בכל שלב של בידול בעקבות הבחנה מכוונת של שליטה ו-DMSO-hESCs שטופלו מצוינים עם SEM של שניים עד ארבעה משכפל ביולוגי. סרגל קנה מידה = 200 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5 : טיפול DMSO הראשונית של hPSCs משפר את התגובה גלוקוז לאחר השתלת של תאים מחולל קדמון בvivo. (A) סכמטי של בידול מכוון (~ 15 ימים) של HUES8 hESCs לתוך תאים מחולל הלבלב (PP2) בעקבות טיפול לא (שליטה) או 24 h 1% טיפול dmso השתלת הבאים (5,000,000 תאים) לתוך החיסוני עכברים מבוססי SCID-בז ‘. (ב) אחוז התאים המבדילים לתוך PDX1 + ו FOXA2 + בתאי מחולל הלבלב בעקבות הבידול בימוי חוץ גופית של השליטה dmso-טופלו hESCs מיד לפני ההשתלה (n = 1). (ג) מתכוון אליסה מדידות של אינסולין אנושי מתוך סרום של עכברים בעקבות נמוך (2.5 מ”מ) או גבוה (15 מ”מ) האתגר גלוקוז או אשלגן כלוריד (kcl) גירוי ב (ג) 2 שבועות ו (ד) 16 שבועות לאחר השתלת הלבלב תאים מחולל קדמון הבדיל מהפקד ו-DMSO-מטופלים hESCs (קווי שגיאה = SEM; n = 3 ב 2 שבועות ו -16 שבועות עבור שליטה; n = 2 ב 2 שבועות ו -16 שבועות עבור DMSO). 2-way ANOVA: p = 0.0051 עבור שליטה vs. DMSO ב 2 שבועות; p = 0.0116 לבקרת לעומת DMSO במהלך 16 שבועות. העכברים למדו בנקודות זמן שונות שונים. תוצאות מותאמים מצ ואח ‘3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר כלי פשוט וזול כדי לשפר את יכולת הבידול של תאי גזע רב עוצמה (PSCs) לכל שכבות הנבט הראשי, סוגים שונים של תאים מיוחדים המתמחה, ואפילו סוגי תאים בוגרים פונקציונלי ב מבחנה ובהגדרות vivo. מומחשים הם פרוטוקולי בידול ספציפיים אשר שוחזרו ביעילות במעבדה שלנו, כמו גם אחרים, אבל כל פרוטוקול הבחנה של בחירה ניתן להשתמש בעקבות הטיפול DMSO. כפי שמוצג בטבלה 1, מספר מעבדות הפגינו גם שיפור של בידול PSC לאחר הטיפול הארעי dmso באמצעות תבניות שונות כדי ליצור סוגים שונים של תאים מסופים אחרים. יתר על כן, למרות השיטות כאן לתאר את השימוש האנושי PSCs, pretreatment טרום טיפול יכול להיות מנוצל על פני מינים, הוכח להיות יעיל בעכבר, ארנב, ו פרימטים PSCs.
למרות מינונים גבוהים יותר של DMSO ידועים להיות ציטוטוקסיני, המינון הנמוך המשמש בשיטה זו (1%-2%) לתוצאה של תקופה ארעית במוות תאים מינימלי. בעוד מספרי התאים הכוללים מיד לאחר טיפול DMSO עלול לרדת בשל הקידום DMSO של מעצר מחזור התא בשלב G1 של מחזור התא, מחקרים קודמים מראים כי התאים מסוגלים להגיע לאותה רמה של שליטה כמו תרבויות בקרה לאחר ההסרה של . היחידה3
האחוז והמשך של טיפול מקדים DMSO צריך להיות ממוטב עבור קו התא. יש לכוונן את זמן הטיפול בהתחשב בזמן הרכיבה וההכפלה של התאים. לדוגמה, העכבר PSCs בדרך כלל יש זמני אופניים קצרים הרבה יותר של כ 15 h; לכן, טיפול DMSO עבור 15 h עבור תאים אלה הוא מספיק. מעבדות מסוימות מצאו גם את הטיפול DMSO להיות מועילים כאשר המשך במהלך הליך בידול או בריכוזים נמוכים (ראה שולחן 1). יש לציין כי כמה קווי PSC יותר amendable לבידול לקווים ספציפיים. לדוגמה, תאים HUES6 הוכחו להיות מתירני פחות כדי בידול ולכן היה מסומן שיפור עם טיפול DMSO (איור 2). לחילופין, HUES8 תאים בשימוש באיור 4 איור 5 הוכחו יש נטייה גבוהה יותר לכיוון בידול אנדועורי; כך, פחות הבדלים הוכחו בין שליטה ו DMSO לבידול בשלבים הראשוניים לכיוון האנדובית מוחלט. עם זאת, השיפור של טרום הטיפול DMSO הוא נצפתה בשלבים מאוחרים יותר של בידול קו זה (איור 4ב). הטיפול DMSO הוא גם רב-תכליתי בכך שהוא יעיל הן 2D ו-3D מערכות תרבויות תא, זה יכול לשמש עם סוגים שונים של חומר ציפוי על לוחות תרבות התא, וזה עובד בסוגים שונים של מדיום תחזוקה לקדם צמיחה והתרחבות של hPSCs (למשל, mTeSR, E8, מדיה ממוזג MEF, וכו ‘).
באופן כללי יותר, תוצאות אלה מראים כי המצב ההתחלתי של תאים גזע pluripotent יש השפעה חזקה על הנטייה לבידול הראשונית, כמו גם בידול מסוף לתוך סוגי תאים פונקציונליים. הצגנו בעבר כי הטיפול dmso פונקציות דרך Rb ב hPSCs3,5. Rb משחק תפקיד חשוב בקידום בידול מסוף, הישרדות התא, ואת היציבות הגנטית של תאים41,42,43,44, ולכן זה יכול להסביר את ההשפעות המתמדת על תאים הובחנים מ-DMSO-מטופלים hPSCs. מיקוד אלה מצבים מוקדמים של רגולציה עשוי למקם hPSCs על מסלול טוב יותר עבור בידול ובסופו של דבר לשפר את השירות שלהם לרפואה רגנרטיבית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מאוניברסיטת סטנפורד בית הספר לרפואה ומלגת חברת Siebel הוענק ל-S. C.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353046 | |
| 9-Position stir plate | Chemglass | CLS-4100 | |
| Accutase | Gibco | 11105-01 | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| Advanced RPMI | Gibco | 12633012 | |
| Alk5i II | Axxora | ALX-270-445 | |
| all-trans retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| anti-Brachyury | R&D Systems | AF2085 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-C-peptide | Developmental Studies Hybridoma Bank | GN-ID4 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-FoxA2 | Millipore | 07-633 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-Nkx2.2 | University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-Nkx6.1 | University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank; | F55A12-supernatant | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-Olig2 | EMD Millipore | MABN50 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-Pax-6 | Biolegend | 901301 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-Pdx1 | R&D Systems | AF2419 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-SOX1 | R&D Systems | AF3369 | No variablity observed across different lot numbers |
| anti-SOX17 | R&D Systems | AF1924 | No variablity observed across different lot numbers |
| B-27 Supplement, minus Vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| basic fibroblast growth factor | Gibco | PHG0264 | |
| Betacellulin | Thermo Fisher Scientific | 50932345 | |
| Chir99021 | Stemgent | 04-000-10 | |
| CMRL 1066 | Corning | 99-603-CV | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAF1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Disposable Spinner Flasks | Corning, VWR | 89089-814 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Essential 6 Media | Gibco | A1516501 | |
| FAF-BSA | Proliant | 68700 | |
| FGF7 | PeproTech | 100-19 | |
| Geltrex | Gibco | A1413202 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Human Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO Diagnostics | 80-INSHUU-E01.1 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500056 | |
| KGF | Peprotech | AF-100-19 | |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| L-3,3′,5-Triiodothyronine (T3) | EMD Millipore | 642245 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354277 | |
| MCDB-131 | Cellgro | 15-100-CV | |
| MEM NEAA | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | StemCell Technologies | 5850 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| NaHCO3 | Sigma | S3817 | |
| Noggin Fc Chimera Protein | R&D Systems | 3344-NG-050 | |
| PdBU | EMD Millipore | 524390 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| Sant1 | Sigma-Aldrich | S4572 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Smoothened Agonist, SAG | EMD Millipore | 566660 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning | 3471 | |
| Vitamin C | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Wnt3a | R&D Systems | 5036-WN | |
| XAV 939 | Tocris | 3748 | |
| XXI | EMD Millipore | 565790 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72302 |
References
- Osafune, K., et al. Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines. Nature Biotechnology. 26 (3), 313-315 (2008).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Review Genetics. 15 (2), 82-92 (2014).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Conklin, J. F., Sage, J. Keeping an eye on retinoblastoma control of human embryonic stem cells. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (5), 1023-1030 (2009).
- Li, J., et al. A transient DMSO treatment increases the differentiation potential of human pluripotent stem cells through the Rb family. PLoS One. 13 (12), 0208110 (2018).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
- Pardee, A. B. G1 events and regulation of cell proliferation. Science. 246 (4930), 603-608 (1989).
- Orford, K. W., Scadden, D. T. Deconstructing stem cell self-renewal: genetic insights into cell-cycle regulation. Nature Review Genetics. 9 (2), 115-128 (2008).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
- Duan, Y., et al. Differentiation and characterization of metabolically functioning hepatocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (4), 674-686 (2010).
- Szkolnicka, D., Farnworth, S. L., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Deriving functional hepatocytes from pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 30, 1-12 (2014).
- Vanhove, J., et al. H3K27me3 Does Not Orchestrate the Expression of Lineage-Specific Markers in hESC-Derived Hepatocytes In Vitro. Stem Cell Reports. 7 (2), 192-206 (2016).
- Kanebratt, K. P., Andersson, T. B. Evaluation of HepaRG cells as an in vitro model for human drug metabolism studies. Drug Metabolism & Disposition. 36 (7), 1444-1452 (2008).
- Nikolaou, N., Green, C. J., Gunn, P. J., Hodson, L., Tomlinson, J. W. Optimizing human hepatocyte models for metabolic phenotype and function: effects of treatment with dimethyl sulfoxide (DMSO). Physiological Reports. 4 (21), (2016).
- Kondo, Y., et al. An efficient method for differentiation of human induced pluripotent stem cells into hepatocyte-like cells retaining drug metabolizing activity. Drug Metabolism Pharmacokinetics. 29 (3), 237-243 (2014).
- Alizadeh, E., et al. The effect of dimethyl sulfoxide on hepatic differentiation of mesenchymal stem cells. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44 (1), 157-164 (2016).
- Czysz, K., Minger, S., Thomas, N. DMSO efficiently down regulates pluripotency genes in human embryonic stem cells during definitive endoderm derivation and increases the proficiency of hepatic differentiation. PLoS One. 10 (2), 0117689 (2015).
- Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 5, 17297 (2015).
- Choi, S. C., et al. Mixl1 and Flk1 Are Key Players of Wnt/TGF-beta Signaling During DMSO-Induced Mesodermal Specification in P19 cells. Journal of Cellular Physiology. 230 (8), 1807-1821 (2015).
- Chetty, S., et al. A Src inhibitor regulates the cell cycle of human pluripotent stem cells and improves directed differentiation. Journal of Cell Biology. 210 (7), 1257-1268 (2015).
- Qiu, Z., et al. Marmoset induced pluripotent stem cells: Robust neural differentiation following pretreatment with dimethyl sulfoxide. Stem Cell Research. 15 (1), 141-150 (2015).
- Swartz, E. W., et al. A Novel Protocol for Directed Differentiation of C9orf72-Associated Human Induced Pluripotent Stem Cells Into Contractile Skeletal Myotubes. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1461-1472 (2016).
- Teimourian, S., Moghanloo, E. Thwarting PTEN Expression by siRNA Augments HL-60 Cell Differentiation to Neutrophil-Like Cells by DMSO and ATRA. DNA Cell Biology. 35 (10), 591-598 (2016).
- van den Berg, C. W., Elliott, D. A., Braam, S. R., Mummery, C. L., Davis, R. P. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes Under Defined Conditions. Methods in Molecular Biology. 1353, 163-180 (2016).
- Deng, F., et al. Combination of retinoic acid, dimethyl sulfoxide and 5-azacytidine promotes cardiac differentiation of human fetal liver-derived mesenchymal stem cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 147-159 (2016).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2018).
- Stratigopoulos, G., De Rosa, M. C., LeDuc, C. A., Leibel, R. L., Doege, C. A. DMSO increases efficiency of genome editing at two non-coding loci. PLoS One. 13 (6), 0198637 (2018).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nature Biotechnology. 26 (4), 443-452 (2008).
- Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
- Douvaras, P., Fossati, V. Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Fiore, M., Degrassi, F. Dimethyl sulfoxide restores contact inhibition-induced growth arrest and inhibits cell density-dependent apoptosis in hamster cells. Experimental Cell Research. 251 (1), 102-110 (1999).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
- Bock, C., et al. Reference Maps of human ES and iPS cell variation enable high-throughput characterization of pluripotent cell lines. Cell. 144 (3), 439-452 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- D’Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Jacks, T., et al. Effects of an Rb mutation in the mouse. Nature. 359 (6393), 295-300 (1992).
- Nguyen, D. X., Baglia, L. A., Huang, S. M., Baker, C. M., McCance, D. J. Acetylation regulates the differentiation-specific functions of the retinoblastoma protein. The EMBO Journal. 23 (7), 1609-1618 (2004).
- Slack, R. S., et al. Cells differentiating into neuroectoderm undergo apoptosis in the absence of functional retinoblastoma family proteins. Journal of Cell Biology. 129 (3), 779-788 (1995).
- Gu, W., et al. Interaction of myogenic factors and the retinoblastoma protein mediates muscle cell commitment and differentiation. Cell. 72 (3), 309-324 (1993).
Cite This Article
Sambo, D., Li, J., Brickler, T., Chetty, S. Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation. J. Vis. Exp. (149), e59833, doi:10.3791/59833 (2019).