הטיפוח-תרגול של החיל הימי ( uljanin 1884) למחקרים ניסיוניים
Summary
Doliolids, כולל את המינים דולילטה gegenbauri, הם קטנים זואופלנקטון הג ימית של משמעות אקולוגית המצויים על מערכות משנה יצרנית המדף ברחבי העולם. הקושי של התקשות האורגניזמים העדינים האלה מגביל את החקירה שלהם. במחקר זה אנו מתארים גישות טיפוח לאיסוף, גידול ושמירה על הdoliolid דולילטה gegenbauri.
Abstract
לגטין זואופלנקקלס משחקים תפקיד מכריע בתוך מערכות אקולוגיות של האוקיינוס. עם זאת, קשה בדרך כלל לחקור את הפיזיולוגיה, הצמיחה, הפוריות והאינטראקציות ההזנה בעיקר עקב אתגרים מתודולוגיים, כולל היכולת להתרבות. הדבר נכון במיוחד לגבי הdoliolid, דולילטה גגנבאורי. ד. gegenbauri בדרך כלל מתרחשת במערכות המדף סובטרופי continental פרודוקטיבי ברחבי העולם, לעתים קרובות בריכוזים פורחים מסוגל לצרוך חלק גדול של הייצור הראשוני היומי. במחקר זה אנו מתארים גישות טיפוח לאיסוף, גידול ואחזקה של ד. gegenbauri לצורך ביצוע מחקרים מבוססי מעבדה. ד. gegenbauri ומינים doliolid אחרים ניתן ללכוד לחיות באמצעות שכאוכלי מאוד נגרר 202 יקרומטר שינוי כילות פלנקטון של הספינה נסחף. תרבויות הן הוקמה באופן אמין ביותר כאשר טמפרטורות המים הן מתחת ל -21 ° c והם התחילו מגונזוסואידים בלתי-מפותחים, התבגרות ואחיות גדולות. תרבויות ניתן לשמור על כלי תרבות מעוגל על גלגל פלנקטון מסתובבת לאט ומתמשכת על דיאטה של אצות תרבותית במי ים טבעיים במשך דורות רבים. בנוסף ליכולת להקים תרביות מעבדה של D. gegenbauri, אנו מדגימים כי מצב האיסוף, ריכוז אצות, טמפרטורה, וחשיפה למי ים ממוזג באופן טבעי כולם קריטיים לתרבות הקמה, צמיחה, הישרדות ורבייה של D. gegenbauri.
Introduction
זואופלנקטון חשבון עבור ביומסה בעלי חיים הגדול ביותר באוקיינוס, הם רכיבי מפתח באתרי מזון ימיים, ולשחק תפקידים חשובים בתוך מחזורי אושן ביוגיאוכימיים1,2. זואופלנקטון, למרות מורכב של מגוון עצום של אורגניזמים, ניתן להבדיל בגסות לשתי קטגוריות: ז’לטין ולא ז’לטין עם מספר ביניים מטקא3,4. לעומת זואופלנקטון שאינם ז’לטין, זואופלנקטון ז’לטין קשים במיוחד ללמידה בשל ההיסטוריה המורכבת שלהם מהחיים5, והרקמות העדינות שלהם ניזוקו בקלות במהלך לכידת וטיפול. מינים זואופלנקטון ז’לטין הם, ולכן, קשה לשמצה התרבות במעבדה ובדרך כלל למדו פחות לעומת מינים שאינם ז’לטין6.
בין קבוצות זואופלנקטון ז’לטין, אחת שופעת ובעלת חשיבות אקולוגית באוקיינוס העולמי הם התאליאכאנים. התאליסים הם מחלקה של מטונפלאים הכוללים את ההוראות סאלפידה, פירוסואידה ודוליאולידה7. Doliolida, באופן קולקטיבי המכונה doliolida, הם קטנים בצורת חבית בריכת שחייה בחינם האורגניזמים שיכולים להגיע הגבוה מחולות שחיה באזורים neritic פורה של אוקיינוסים סובטרופי. Doliolids הם בין הנפוצים ביותר של כל זואופלנקטון קבוצות4,8. כמו מזינים ההשעיה, doliolids לאסוף חלקיקי מזון מעמודת המים על ידי יצירת זרמים מסנן לכידת אותם על רשתות ריר9. באופן מטקאני, doliolids מסווגים ב-מערכה שאורונתונים10. אב קדמון לבני הזוג, ובנוסף למשמעות האקולוגית שלהם כמרכיבים מרכזיים של מערכות מרכזיות ימיות, הם משמעותיות להבנת מקורותיה של תולדות החיים הקולוניאליים10,11 והאבולוציה , מהדמית הרוח5,7,10.12,13,14
ההיסטוריה החיים של doliolids הוא מורכב תורם את הקושי של culturing ולקיים אותם באמצעות מחזור החיים שלהם. ניתן למצוא סקירה של מחזור החיים הdoliolid והאנטומיה בגובדו אל15. מחזור החיים הdoliolid, הכרוך בשלבי התעללות מיניים והיסטוריה מינית, מוצג באיור 1. ביצים וזרע מיוצרים על ידי זיבה, השלב הבודד היחיד במחזור החיים. גונזואידים משחררים זרע לעמודת המים וביצים מופרות ומשתחררים להתפתח לזחלים. הזחלים לבקוע ומהפך לתוך האוזואידים שיכולים להגיע 1-2 מ”מ. בהנחה לטיפול בתנאי הסביבה ובתזונה, הפכו האחים המוקדמים לאחיות בתוך 1-2 ימים ב-20 ° c ומפעילים את השלבים הקולוניאליים של מחזור החיים. בעלי החיים מייצרים בלוטות. מיניות על התחת שלהם ניצנים אלה להשאיר את הסטעל ולהגר למטה המאמצים האחרונים שבו הם בשורה בשלוש שורות מזווג. השורות המרכזיות הופכות לפלואוזואידים ולשתי השורות החיצוניות הופכות לטרוזואידים. האחרון מספק מזון הן לאחות והן לבני הפאורוזואידים16,17. בזמן שהיא מאבדת. את כל האיברים הפנימיים ככל ששפע של הטרופואידים גדל, גודל האחות יכול להגיע 15 מ”מ במעבדה. כמו phorozooids לצמוח, הם יותר ויותר לבלוע טרף פלנקטון ולהגיע ~ 1.5 מ”מ בגודל לפני שוחרר כמו יחידים17. אחות בודדת עשויה לשחרר את > 100 phorozooids במהלך תוחלת החיים שלה18. לאחר שחרור הפאורוזואידים מהפתבים, הם ממשיכים לצמוח והם השלב הקולוניאלי השני של מחזור החיים. ברגע שהם מגיעים ~ 5 מ”מ בגודל, כל phoroבאיד מפתחת מקבץ של גונדוזואידים על הדוד שלהם מדווש. הגונזואידים האלה יכולים לבלוע חלקיקים כשהם מגיעים ~ 1 מ”מ באורך. לאחר שהגונזואידים הגיעו ~ 2 עד 3 מ”מ בגודלם הם שוחררו מן phorozooid ולהיות השלב הבודד היחיד של מחזור החיים. ברגע שהם מגיעים ~ 6 מ”מ בגודל, הגונזואידים להפוך בוגרת מינית17. הגונזואידים יכולים להגיע לאורך 9 מ”מ או יותר. גונסוזואידים הם מרמוניסטיים, זרע משוחרר לסירוגין בעוד הפריה הביצים מתרחשת באופן פנימי16,17. כאשר ה≥ בגודל של 6 מ”מ, הוא משחרר עד 6 ביצים מופרות. Culturing מוצלחת דורש תמיכה בצרכים הספציפיים של כל אחד משלבי ההיסטוריה הייחודיים האלה של החיים.
בשל המשמעות האקולוגית והאבולוציונית של התאליסים, כולל doliolids, קיים צורך במתודולוגיות הטיפוח לקדם את ההבנה של הביולוגיה הייחודית, הפיזיולוגיה, האקולוגיה וההיסטוריה האבולוציונית של האורגניזם הזה19 . Doliolids יש הבטחה ניכרת כמו אורגניזמים מודל ניסיוני בביולוגיה התפתחותית גנומיקה תפקודית משום שהם שקופים וכנראה יש גנום יעיל20,21. לעומת זאת, חוסר שיטות הטיפוח האמינות מעכבת את התועלת שלהם כמודלים מעבדתיים. למרות קומץ של מעבדות פרסמו תוצאות המבוססות על doliolids תרבותי, לגישות הידע שלנו ופרוטוקולים מפורטים לא פורסמו בעבר. בהתבסס על שנות ניסיון, ניסיון וטיפוח שגיאה, מטרת מחקר זה הייתה לסקור חוויות ולשתף פרוטוקולים לאוסף ולטיפוח של doliolids, במיוחד את המין המיני דולילטה gegenbauri.
Protocol
Representative Results
Discussion
הקיבולת של doliolids התרבות הוקמה במהלך העשורים האחרונים ושימש לתמיכה במחקר במספר תחומים. מחקרים ניסיוניים במעבדות שלנו תמכו בפרסום של לפחות 15 מחקרים מדעיים התמקדו האכלה וצמיחה18,26, רבייה18,28, דיאטה6, 2…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה לאנשים רבים שתרמו ידע שנצבר לפרויקט זה במהלך השנים כולל G.-A. Paffenhöfer וד. דימוס שפיתחו את הפרוטוקולים האלה במקור מ. קייסטר, ול’ למברלי תרמו גם הם באופן משמעותי לפיתוח ההליכים הללו. N.B. לופס-פיגרואה ו-האדרגס-סנטיאגו יצרו את האומדנים של doliolid שפע שניתן בטבלה 1. מחקר זה היה נתמך בחלקו על ידי הקרן הלאומית המדע הלאומי פרסים OCE 082599, 1031263 MEF, פרויקטים שיתופיים OCE 1459293 ו OCE 14595010 כדי MEF ו DMG, הלאומית הלאומי והאטמוספירה המינהל פרס NA16SEC4810007 ל DMG. אנו אסירי תודה לצוות החרוץ והמקצועי של סוואנה. לי אן דלאו הכין את הדמויות, צ’ארלס י. רוברטסון הגהה על כתב היד וג (ג’ימי) ויליאמס ייצרה את גלגל הפלנקטון
Materials
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow – should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50×5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
References
- Banse, K. Zooplankton – Pivotal role in the control of ocean production. Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).
- Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Bode, A., Álvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region. Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).
- Kiorboe, T. Zooplankton body composition. Limnology and Oceanography. 58 (5), 1843-1850 (2013).
- Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), R146-R152 (2016).
- Walters, T. L., et al. Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884). Molecular Ecology. , (2018).
- Piette, J., Lemaire, P. Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma. Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).
- Acuña, J. L. Pelagic tunicates: Why gelatinous?. American Naturalist. 158 (1), 100-107 (2001).
- Alldredge, A. L., Madin, L. P. Pelagic tunicates – unique herivores in the marine plankton. Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).
- Wada, H. Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny. Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).
- Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians. Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Garstang, W. The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata. Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).
- Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P. A molecular phylogeny of the Thaliacea. Journal of Plankton Research. 33 (6), 843-853 (2011).
- Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C., Bone, Q. . The Biology of Pelagic Tunicates. , 1-24 (1998).
- Deibel, D., Lowen, B. A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions). Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369 (2012).
- Paffenhöfer, G., Köster, M. From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).
- Paffenhöfer, G. A., Gibson, D. M. Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).
- Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. Mammoth grazers on the ocean’s minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370 (2009).
- Denoeud, F., et al. Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate. Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).
- Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology. 16 (1), 2835 (1980).
- Ohman, M. D., et al. Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton. Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).
- Takahashi, K., et al. In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs. Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).
- Deibel, D., Bone, Q. . The biology of pelagic tunicates. , 171-186 (1998).
- Gibson, D. M., Paffenhöfer, G. A. Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).
- Haskell, A., Hofmann, E., Paffenhöfer, G., Verity, P. Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf. Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).
- Gibson, D. M., Paffenhöffer, G. A. Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).
- Frischer, M. E., et al. Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea). Food Webs. 1, 7 (2014).
- Köster, M., Paffenhöfer, G., Baker, C., Williams, J. Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).
- Paffenhöfer, G. A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).
- Takahashi, K., et al. Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux. Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages. Development Growth & Differentiation. 50, S239-S256 (2008).
