Cultivo del Tenicato Pelágico Marino Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) para Estudios Experimentales
Summary
Los doliolids, incluyendo la especie Dolioletta gegenbauri,son pequeños zooplancton marinos gelatinosos de importancia ecológica que se encuentran en los sistemas productivos de estanterías subcontinentales en todo el mundo. La dificultad de cultivar estos delicados organismos limita su investigación. En este estudio, describimos los enfoques de cultivo para la recolección, cría y mantenimiento de la doliolida Dolioletta gegenbauri.
Abstract
Los zooplanktos gelatinosos desempeñan un papel crucial en los ecosistemas oceánicos. Sin embargo, generalmente es difícil investigar su fisiología, crecimiento, fecundidad e interacciones tróficas principalmente debido a desafíos metodológicos, incluyendo la capacidad de cultivarlos. Esto es particularmente cierto para el doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri ocurre comúnmente en sistemas productivos de estanterías continentales subtropicales en todo el mundo, a menudo a concentraciones de floración capaces de consumir una gran fracción de la producción primaria diaria. En este estudio, describimos los enfoques de cultivo para recolectar, criar y mantener D. gegenbauri con el propósito de realizar estudios basados en laboratorio. D. gegenbauri y otras especies de doliolid pueden ser capturados en vivo usando redes de plancton de malla remolcadas oblicuamente de 202 m de un barco a la deriva. Los cultivos se establecen de forma más fiable cuando las temperaturas del agua están por debajo de los 21 oC y se inician a partir de gonozooides inmaduros, farorzooides madurantes y enfermeras grandes. Los cultivos pueden mantenerse en recipientes de cultivo redondeados en una rueda de plancton giratoria lenta y mantenerse en una dieta de algas cultivadas en agua de mar natural durante muchas generaciones. Además de la capacidad de establecer cultivos de laboratorio de D. gegenbauri,demostramos que la condición de recolección, la concentración de algas, la temperatura y la exposición al agua de mar naturalmente condicionada son fundamentales para el cultivo crecimiento, supervivencia y reproducción de D. gegenbauri.
Introduction
Zooplancton representan la mayor biomasa animal en el océano, son componentes clave en las redes de alimentos marinos, y desempeñan un papel importante en los ciclos biogeoquímicos oceánicos1,2. Zooplancton, aunque compuesto por una gran diversidad de organismos, se puede distinguir en dos categorías: gelatinosa y no gelatinosa con pocos taxones intermedios3,4. En comparación con el zooplancton no gelatinoso, el zooplancton gelatinosoes especialmente difícil de estudiar debido a sus complejas historias de vida 5, y sus delicados tejidos se dañan fácilmente durante la captura y manipulación. Las especies de zooplancton gelatinoso son, por lo tanto, notoriamente difíciles decultivar en el laboratorio y generalmente menos estudiadas en comparación con las especies no gelatinosas 6.
Entre los grupos gelatinosos de zooplancton, uno abundante y de importancia ecológica en el océano del mundo son los thaliaceanos. Los thaliaceans son una clase de tunicados pelágicos que incluyen los órdenesSalpida, Pyrosomida y Doliolida 7. Los doliolida, denominados colectivamente doliolids, son pequeños organismos pelágicos de natación libre en forma de barril que pueden alcanzar altas abundancias en regiones neríticas productivas de los océanos subtropicales. Los doliolids se encuentran entre los más abundantes de todos los grupos de zooplancton4,8. Como alimentadores de suspensión, los doliolids recogen partículas de alimentos de la columna de agua creando corrientes de filtro y capturándolas en redes de moco9. Taxonómicamente, los doliolids se clasifican en el phylum Urochordata10. Ancestrales a los cordados, y además de su importancia ecológica como componentes clave de los sistemas pelágicos marinos, los thaliaicos son de importancia para entender los orígenes de la historia colonial10,11 y la evolución de los cordatos5,7,10,12,13,14.
La historia de vida de los doliolids es compleja y contribuye a la dificultad para cultivarlos y sostenerlos a lo largo de su ciclo de vida. Una revisión del ciclo de vida doliolid y la anatomía se puede encontrar en Godeaux et al.15. El ciclo de vida doliolid, que implica una alternancia obligatoria entre las etapas de la historia de la vida sexual y asexual, se presenta en la Figura1. Los óvulos y espermatozoides son producidos por los gonozooides hermafroditas, la única etapa solitaria del ciclo de vida. Los gonozooides liberan espermatozoides a la columna de agua y los óvulos son fertilizados internamente y liberados para convertirse en larvas. Las larvas eclosionan y metorfican en oozooides que pueden alcanzar 1-2 mm. Suponiendo condiciones ambientales y nutrición propicias, los oozooides se convierten en enfermeras tempranas dentro de 1-2 días a 20 oC e inician las etapas coloniales del ciclo de vida. Los oozooides producen asexualmente brotes en su eston ventral. Estos cogollos salen del estony migran al cadoforo dorsal donde se alinean en tres filas emparejadas. Las filas dobles centrales se convierten en phorozooides y las dos filas dobles externas se convierten en trophozooides. Estos últimos proporcionan alimento tanto a la enfermera como a los farorozooides16,17. Los trophozooides suministran nutrición a la enfermera, ya que pierde todos los órganos internos. A medida que aumenta la abundancia de trophozooides, el tamaño de la enfermera puede alcanzar los 15 mm en el laboratorio. A medida que los farorozooides crecen, ingenian cada vez más presas planctónicas y alcanzan 1,5 mm de tamaño antes de ser liberados como individuos17. Una sola enfermera puede liberar > 100 phorozooides durante su vida útil18. Después de que los farorozooides son liberados del cadoforo, siguen creciendo y son la segunda etapa colonial del ciclo de vida. Una vez que alcanzan los 5 mm de tamaño, cada phorozooide desarrolla un racimo de gonozooides en su pedúnculo ventral. Estos gonozooides pueden ingerir partículas cuando alcanzan 1 mm de longitud. Después de que los gonozooides han alcanzado de 2 a 3 mm de tamaño, se liberan del phorozooide y se convierten en la única etapa solitaria del ciclo de vida. Una vez que alcanzan los 6 mm de tamaño, los gonozooides se vuelven sexualmente maduros17. Los gonozooides pueden alcanzar 9 mm o más de longitud. Los gonozooides son hermafroditas, los espermatozoides se liberan intermitentemente mientras que la fertilización de los óvulos ocurre internamente16,17. Cuando el gonozooide tiene un tamaño de 6 mm, libera hasta 6 óvulos fertilizados. El cultivo exitoso requiere apoyar las necesidades específicas de cada una de estas etapas únicas de la historia de la vida.
Debido a la importancia ecológica y evolutiva de los thaliaceanos, incluidos los doliolids, es necesario que las metodologías de cultivo avancen en la comprensión de la biología, fisiología, ecología e historia evolutiva únicas de este organismo19 . Los doliolids tienen una promesa considerable como organismos modelo experimentales en biología del desarrollo y genómica funcional porque son transparentes y probablemente tienen genomas simplificados20,21. La falta de métodos de cultivo fiables, sin embargo, impide su utilidad como modelos de laboratorio. Aunque un puñado de laboratorios han publicado resultados basados en doliolides cultivados, a nuestroconocimiento no se han publicado previamente enfoques de cultivo y protocolos detallados. Basándose en años de experiencia, y los intentos de cultivo de ensayos y errores, el propósito de este estudio fue revisar experiencias y compartir protocolos para la recolección y cultivo de doliolids, específicamente la especie Dolioletta gegenbauri.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacidad de cultivar doliolids se ha establecido en las últimas décadas y se ha utilizado para apoyar la investigación en varias áreas. Los estudios experimentales en nuestros laboratorios han apoyado la publicación de al menos 15 estudios científicos centrados en la alimentación y el crecimiento18,26,reproducción18,28, dieta6, 29, fi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a las muchas personas que han aportado conocimiento acumulado a este proyecto a lo largo de los años, incluyendo G.-A. Paffenháfer y D. Deibel que originalmente desarrollaron estos protocolos. M. K-ster, y L. Lamboley también han contribuido significativamente al desarrollo de estos procedimientos. N.B. López-Figueroa y el S.E. Rodríguez-Santiago generaron las estimaciones de abundancia de doliolidas proporcionadas en la Tabla 1. Este estudio fue apoyado en parte por los premios OCE 082599, 1031263 a MEF, proyectos colaborativos OCE 1459293 y OCE 14595010 a MEF y DMG y, el premio Nacional de Administración Oceánica y Atmosférica NA16SEC4810007 a DMG. Estamos agradecidos a la tripulación trabajadora y profesional de la R / V Savannah. Lee Ann DeLeo preparó las figuras, Charles Y. Robertson aprueba el manuscrito y, James (Jimmy) Williams fabricó la rueda de plancton
Materials
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow – should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50×5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
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