Cultivation du Tunicate pélagique marin Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) pour les études expérimentales
Summary
Les doliolides, y compris l’espèce Dolioletta gegenbauri, sont de petits zooplanctonmarins marins gélatineux d’importance écologique que l’on trouve sur les plateaux sous-continentaux productifs du monde entier. La difficulté de cultiver ces organismes délicats limite leur recherche. Dans cette étude, nous décrivons les approches de culture pour la collecte, l’élevage et l’entretien du doliolide Dolioletta gegenbauri.
Abstract
Les zooplanktons gélatineux jouent un rôle crucial dans les écosystèmes océaniques. Cependant, il est généralement difficile d’étudier leur physiologie, leur croissance, leur fécondité et leurs interactions trophiques principalement en raison de défis méthodologiques, y compris la capacité de les culture. Cela est particulièrement vrai pour le doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri se produit généralement dans les systèmes subtropicaux productifs de plateau continental dans le monde entier, souvent à des concentrations de floraison capables de consommer une grande fraction de la production primaire quotidienne. Dans cette étude, nous décrivons des approches de culture pour la collecte, l’élevage et le maintien de D. gegenbauri dans le but de mener des études en laboratoire. D. gegenbauri et d’autres espèces de dolioldes peuvent être capturés vivants à l’aide de filets de plancton à mailles coniques obliquement remorquées de 202 m à partir d’un navire à la dérive. Les cultures sont les plus fiables établies lorsque les températures de l’eau sont inférieures à 21 oC et sont commencées à partir de gonozooides immatures, de phorozooïdes en maturation et de grandes infirmières. Les cultures peuvent être maintenues dans des récipients de culture arrondis sur une roue de plancton tournant lentement et soutenues sur un régime des algues cultivées dans l’eau de mer normale pendant beaucoup de générations. En plus de la capacité d’établir des cultures de laboratoire de D. gegenbauri, nous démontrons que l’état de collecte, la concentration d’algues, la température et l’exposition à l’eau de mer naturellement conditionnée sont tous essentiels à la culture l’établissement, la croissance, la survie et la reproduction de D. gegenbauri.
Introduction
Le compte de zooplancton pour la plus grande biomasse animale dans l’océan, sont des composants clés dans les réseaux alimentaires marins, et jouent un rôle important dans les cycles biogéochimiques océaniques1,2. Le zooplancton, bien que composé d’une grande diversité d’organismes, peut être grossièrement distingué en deux catégories: gélatineux et non-gélatineux avec peu de taxons intermédiaires3,4. Comparé au zooplancton non-gélatineux, le zooplancton gélatineux est particulièrement difficile àétudier en raison de leurs histoires de vie complexes 5, et leurs tissus délicats sont facilement endommagés pendant la capture et la manipulation. Les espèces de zooplancton gélatineux sont donc notoirement difficiles à culture en laboratoire et généralementmoins étudiées que les espèces non gélatineuses 6.
Parmi les groupes de zooplancton gélatineux, un abondant et d’importance écologique dans l’océan du monde sont les Thaliacéens. Les Thaliacéens sont une classe de tuniciers pélagiques qui incluent les ordres Salpida, Pyrosomida, et Doliolida7. Les Doliolida, collectivement appelées doliolides, sont de petits organismes pélagiques en forme de baril qui peuvent atteindre des abondances élevées dans les régions nerveuses productives des océans subtropicaux. Les doliolides sont parmi les plus abondants de tous les groupes de zooplancton4,8. En tant que mangeoires de suspension, les doliolides recueillent les particules alimentaires de la colonne d’eau en créant des courants de filtre et en les capturant sur les filets de mucus9. Taxonomiquement, les doliolides sont classés dans le phylum Urochordata10. Ancestral aux chordates, et en plus de leur importance écologique en tant que composants clés des systèmes pélagiques marins, les Thaliacéens sont d’importance pour comprendre les origines de l’histoire de la vie coloniale10,11 et l’évolution des chordates5,7,10,12,13,14.
L’histoire de la vie des doliolides est complexe et contribue à la difficulté de les cultiver et de les soutenir tout au long de leur cycle de vie. Un examen du cycle de vie et de l’anatomie doliolid peut être trouvé dans Godeaux et autres15. Le cycle de vie doliolid, qui implique une alternance obligatoire entre les stades de l’histoire de la vie sexuelle et asexuée, est présenté dans la figure 1. Les ovules et le sperme sont produits par les gonozooides hermaphroditiques, la seule étape solitaire du cycle de vie. Les gonozooides libèrent le sperme dans la colonne d’eau et les œufs sont fécondés à l’interne et relâchés pour se développer en larves. Les larves éclosent et se métamorphosent en oozooïdes pouvant atteindre 1 à 2 mm. En supposant des conditions environnementales et une nutrition favorables, les oozooïdes deviennent des infirmières précoces dans un délai de 1 à 2 jours à 20 oC et initient les étapes coloniales du cycle de vie. Les oozooides produisent asexué des bourgeons sur leur stolon ventral. Ces bourgeons quittent le stolon et migrent vers le cadophore dorsal où ils s’alignent en trois rangées jumelées. Les doubles rangées centrales deviennent des phorozooïdes et les deux rangées doubles extérieures deviennent des trophozooïdes. Ces derniers fournissent de la nourriture à la fois à l’infirmière et aux phorozooïdes16,17. Les trophozooïdes fournissent à l’infirmière de la nutrition car elle perd tous les organes internes. Comme l’abondance des trophozooïdes augmente, la taille de l’infirmière peut atteindre 15 mm en laboratoire. À mesure que les phorozooïdes grandissent, ils ingèrent de plus en plus de proies planctoniques et atteignent 1,5 mm de taille avant d’être relâchés à l’instar de17individus. Une seule infirmière peut libérer 100 phorozooïdes au cours de sa durée de vie18. Après que les phorozooïdes sont libérés du cacophore, ils continuent à se développer et sont la deuxième étape coloniale du cycle de vie. Une fois qu’ils atteignent la taille de 5 mm, chaque phorozooid développe un groupe de gonozooides sur leur pédoncule ventral. Ces gonozooides peuvent ingérer des particules lorsqu’elles atteignent 1 mm de longueur. Une fois que les gonozooides ont atteint une taille de 2 à 3 mm, ils sont libérés du phorozooide et deviennent la seule étape solitaire du cycle de vie. Une fois qu’ils atteignent la taille de 6 mm, les gonozooides deviennent sexuellement matures17. Les gonozooides peuvent atteindre 9 mm ou plus de longueur. Gonozooids sont hermaphroditiques, le sperme est libéré par intermittence tandis que la fécondation des œufs se produit à l’interne16,17. Lorsque le gonozooid mesure 6 mm, il libère jusqu’à 6 œufs fécondés. La culture réussie exige de soutenir les besoins spécifiques de chacune de ces étapes uniques de l’histoire de la vie.
En raison de l’importance écologique et évolutive des Thaliacéens, y compris les doliolides, il est nécessaire que les méthodologies de culture fassent progresser la compréhension de la biologie, de la physiologie, de l’écologie et de l’histoire évolutive uniques de cet organisme19. . Les doliolides sont très prometteurs en tant qu’organismes modèles expérimentaux en biologie du développement et en génomique fonctionnelle parce qu’ils sont transparents et ont probablement rationalisé les génomes20,21. L’absence de méthodes de culture fiables, cependant, empêche leur utilité en tant que modèles de laboratoire. Bien qu’une poignée de laboratoires aient publié des résultats basés sur des doliolides cultivés, nos approches de culture du savoir et nos protocoles détaillés n’ont pas été publiées auparavant. Basé sur des années d’expérience, et des tentatives de culture d’essais et d’erreurs, le but de cette étude était d’examiner les expériences et de partager des protocoles pour la collecte et la culture des doliolides, en particulier l’espèce Dolioletta gegenbauri.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacité de culture des doliolides a été établie au cours des dernières décennies et a été utilisée pour soutenir la recherche dans plusieurs domaines. Les études expérimentales dans nos laboratoires ont soutenu la publication d’au moins 15 études scientifiques axées sur l’alimentation et la croissance18,26, reproduction18,28, régime6, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants aux nombreuses personnes qui ont contribué aux connaissances accumulées à ce projet au fil des ans, y compris G.-A. Paffenh-fer et D. Deibel qui ont initialement développé ces protocoles. M. Koster et L. Lamboley ont également contribué de manière significative à l’élaboration de ces procédures. N.B. Làpez-Figueroa et ‘E. Rodràguez-Santiago ont généré les estimations de l’abondance doliolid fournies dans le tableau 1. Cette étude a été soutenue en partie par la National Science Foundation des États-Unis qui décerne l’OCE 082599, 1031263 au MEF, les projets collaboratifs OCE 1459293 et OCE 14595010 à MEF et DMG et, le prix NA16SEC48810007 de la National Oceanic and Atmospheric Administration à DMG. Nous sommes reconnaissants à l’équipage travailleur et professionnel de la Savane R/V. Lee Ann DeLeo a préparé les chiffres, Charles Y. Robertson a relu le manuscrit et, James (Jimmy) Williams a fabriqué la roue de plancton
Materials
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow – should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50×5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
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