טיהור חלבון המסה המולקולרי הגבוה בסטרפטוקוקוס
Summary
מתוארים כאן היא שיטה פשוטה לטיהור של מוצר הגן ב סטרפטוקוקוס מויזוף. טכניקה זו עשויה להיות יתרון על טיהור של חלבונים, בעיקר חלבונים הממברנה וחלבונים המוניים גבוה המולקולרי, והוא יכול לשמש עם מינים שונים חיידקים אחרים.
Abstract
ההסבר של הפונקציה של הגן בדרך כלל כרוך השוואה של תכונות פנוטיפ של זנים סוג פראי וזנים שבו הגן של העניין שובשו. אובדן של פונקציה בעקבות הפרעה גנטית שוחזר לאחר מכן על ידי תוספת אקסודוגני של המוצר של הגן שיבש. זה עוזר לקבוע את התפקיד של הגן. שיטה שתוארה בעבר כרוכה ביצירת מתח Gtfc שיבש סטרפטוקוקוס השיזוף . כאן, שיטה בלתי תובענית מתוארת לטיהור המוצר הגנטי Gtfc מן המתח החדש שנוצר בעקבות הפרעה גנטית. זה כרוך תוספת של רצף polyhistidine-קידוד בסוף 3 ′ של הגן של עניין, אשר מאפשר טיהור פשוט של המוצר הגן באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה מתכת ללא קיבוע. אין תגובות אנזימטיות מלבד ה-PCR נדרשים לשינוי גנטי בשיטה זו. השחזור של מוצר הגן על ידי התוספת אקסוסוגני לאחר הפרעה גנטית היא שיטה יעילה לקביעת פונקציה גנטית, אשר עשוי גם להיות מותאם למינים שונים.
Introduction
ניתוח של הפונקציה של הגן בדרך כלל כרוך השוואה של תכונות פנוטיפ של זנים מסוג פראי לזנים בהם הגן של העניין שובשו. ברגע שהוא מופק זן גנטי, תוספת אקסוגני של המוצר הגן מאפשר שיקום פונקציונלי.
השיטה הנפוצה ביותר להשגת מוצרי גנים מטוהרים הנדרשים עבור שחזור שלאחר השחזור הוא על ידי ביצוע ביטוי הטרוולוגי בשנת הכלאיים קולי1. עם זאת, הביטוי של חלבונים הממברנה או חלבונים מסה גבוהה המולקולרי הוא לעתים קרובות קשה באמצעות מערכת זו1. במקרים אלה, חלבון היעד מבודד בדרך כלל מן התאים המהווה באופן מקורי את החלבון באמצעות סדרה מורכבת של צעדים, אשר עשוי להוביל לאובדן מוצר הגן. כדי להתגבר על בעיות אלה, הליך פשוט פותחה עבור טיהור מוצר גנטי בעקבות הפרעה גנטית שיטה2, pcr מבוססי DNA שילוב שיטה3 (המיועד היתוך שני שלבים PCR), ו אלקטרופורציה גנטית טרנספורמציה בתוך סטרפטוקוקוס. תוספת של תג polyhistidine (שלו-tag) כדי C-הטרמינוס של המוצר הגן מקלה על טיהור שלה על ידי קיבוע מתכת כרומטוגרפיה של זיקה (IMAC).
כדי לבודד את הטאג ‘ שלו-הבעת מאמץ, את ה-DNA כל גנומית של הגן של עניין (בתוך זה שלו-tag-הבעת זן גן שיבשו) מוחלף גנים סמן אנטיביוטי עמידים. ההליך ליצירת התגים שלו-ביטוי שהוניס כמעט זהה לזה ליצירת זן גנים שיבשו כפי שמתואר קודם לכן4,5. לכן, השיטות עבור שיבוש גנים ובידוד המוצר הגנטי יש לבצע כניסויים סדרתיים עבור ניתוח פונקציונלי.
בעבודה הנוכחית, רצף polyhistidine-קידוד מצורף לקצה של 3 ′ של Gtfc (מקום genbank תג SMU_1005) גן, קידוד glucosyltransferase-SI (gtfc-si) ב S. מוסטנים6. לאחר מכן, בוצעו לימודי ביטויים במינים מסוג streptococcal. השגת ביטוי הטרוולוגי ב- E. coli קשה, כנראה בגלל המסה המולקולרית הגבוהה של gtfc-SI. הנבגהזה נקרא . אס. תרשים סכמטי המתאר את הארגון של ה- gtfc וspectinomycin ההתנגדות הגנטית( spcr)7 הבית בסוג פראי . מוסטנים והנגזרים שלו מוצג ב איור 1. GTF-SI הוא חלבון הסוד שתורם להתפתחות של ביוגניים שיניים מקרגני6. תחת נוכחותו של סוכרוז, הארגון משקיף על משטח זכוכית חלק במתח של WT, אבל לא ב-s. המתח המובש(Δ gtfc)2,5 . היווצרות ביוגניים משוחזר ב -S. mutans gtfc בתוספת אקסוגני של רקומביננטי gtfc-SI. המתח, S. mutans שלו-gtfc, משמש לאחר מכן כדי לייצר את gtfc-SI.
Protocol
Representative Results
Discussion
עיצוב התחל הוא הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול. רצפי של Gtfc-הפוכה ו- spcr-קדימה נקבע באופן אוטומטי על בסיס רצפים של שניהם אזור סוף 3 ′ של gtfc ו 5 ′ קצה אזור של spcr. כל פריימר כולל 24 בסיסים משלימים הקודדים מקשר GS ורצף התגים שלו-coding באזורים 5 ‘ שלהם. שיבוש רצפי הרגולציה הילי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) (להעניק מספרים 16K15860 ו 19K10471 ל T. M, 17K12032 ל-M. I., ו 18K09926 ל N. H.) וקרן המדע והטכנולוגיה SECOM (SECOM) (גרנט מספר 2018.09.10 מס ‘ 1).
Materials
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
- Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Database, J. S. E. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. Gel Purification. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Wingfield, P. T. Protein precipitation using ammonium sulfate. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
- Database, J. S. E. Separating Protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
