Summary

تنقية بروتين كتلة جزيئية عالية في موتان العقدية

Published: September 14, 2019
doi:

Summary

وصف هنا هو طريقة بسيطة لتنقية منتج الجينات في موتان العقدية. قد تكون هذه التقنية مفيدة في تنقية البروتينات، وخاصة بروتينات الغشاء والبروتينات الكتلية الجزيئية العالية، ويمكن استخدامها مع مختلف الأنواع البكتيرية الأخرى.

Abstract

وينطوي توضيح وظيفة الجين عادة على مقارنة الصفات الفينوتية للسلالات والسلالات البرية التي تعطل فيها جين الفائدة. يتم استعادة فقدان الوظيفة بعد انقطاع الجينات في وقت لاحق عن طريق إضافة خارجية للمنتج من الجين المعطلة. وهذا يساعد على تحديد وظيفة الجين. وتنطوي الطريقة التي سبق وصفها على توليد سلالة موتان العقدية التي تعطلت في الجينات gt. هنا، يتم وصف طريقة لا تتطلب لتنقية المنتج الجيني gtfC من سلالة S. mutans التي تم إنشاؤها حديثا بعد اضطراب الجينات. هو يتضمّن الإضافة من [بولهيستيدين-كدينغ] تسلسل في ال 3′ نهاية من المورثة الفائدة, أيّ يسمح تنقية بسيطة من المورّة منتوج يستعمل محصّلة معدنة تقارب كروماتوغرافيا. لا توجد ردود فعل أنزيمية غير PCR مطلوبة للتعديل الجيني في هذه الطريقة. واستعادة المنتج الجيني عن طريق إضافة خارجية بعد تعطيل الجينات هي طريقة فعالة لتحديد وظيفة الجينات، والتي يمكن أيضا تكييفها مع الأنواع المختلفة.

Introduction

وعادة ما ينطوي تحليل وظيفة الجين على مقارنة الصفات الفينوتية للسلالات البرية بالسلالات التي تعطل فيها جين الفائدة. وبمجرد إنتاج السلالة التي تعطلت الجينات، فإن الإضافة الخارجية للمنتج الجيني تسمح باستعادة وظيفية.

الطريقة الأكثر شيوعا للحصول على منتجات الجينات النقية اللازمة لتجارب الترميم اللاحقة هي عن طريق أداء التعبير غير المتجانس في الإشريكية القولونية1. ومع ذلك، فإن التعبير عن بروتينات الغشاء أو البروتينات الكتلية العالية غالبا ما يكون من الصعب استخدام هذا النظام1. في هذه الحالات، عادة ما يتم عزل البروتين المستهدف من الخلايا التي تجمع البروتين أصلا من خلال سلسلة معقدة من الخطوات، والتي قد تؤدي إلى فقدان المنتج الجيني. للتغلب على هذه القضايا، تم تطوير إجراء بسيط لتنقية المنتجات الجينية بعد طريقة تعطيل الجيناتطريقة ربط الحمض النووي المستندة إلى PCR3 (المعينة ثنائي ونفي من خطوتين PCR)، والكهرباء للجينات التحول في موتات العقدية. إضافة علامة polyhistidine (له العلامة) إلى C-terminus من المنتج الجيني يسهل تنقية من قبل الكروماتوغرافيا المعدنية تقارب المعطلة (IMAC).

لعزل سلالة التعبير عن علاماته، يتم استبدال الحمض النووي الجينومي الكامل للجين موضع الاهتمام (في هذه السلالة التي تعبر عن الجينات التي تم التعبير عنها) بجين علامة مقاوم للمضادات الحيوية. إجراء لتوليد سلالة له العلامة التعبير عن متطابقة تقريبا لتلك التي لتوليد سلالة الجينات تعطل كما هو موضح سابقا4,5. ولذلك، ينبغي تنفيذ أساليب تعطيل الجينات وعزل المنتجات الجينية كتجارب متسلسلة للتحليل الوظيفي.

في العمل الحالي، يتم إرفاق تسلسل الترميز polyhistidine إلى نهاية 3′ من gtfC (GenBank locus tag SMU_1005) الجينات، ترميز غلوكوزيلترانسفيراز-SI (GTF-SI) في S. mutans6. ثم أجريت دراسات التعبير في الأنواع العقدية. تحقيق التعبير gt fC غير متجانسة من قبل E. القولونية من الصعب، على الأرجح بسبب الكتلة الجزيئية العالية من GTF-SI. هذه السلالة تدعى س. موتانس له-gtfC. رسم تخطيطي يصور تنظيم GTFC وspectinomycin كاسيت الجينات المقاومة(sPCr)7 loci في البرية من نوع S. mutans (S. mutans WT) وتظهر مشتقاته في الشكل 1 وGTF-SI هو بروتين إفرازي الذي يساهم في تطوير biofilm الأسنان المسببة للسرطان6. تحت وجود السكروز، لوحظ biofilm الملتصق على سطح زجاجي أملس في سلالة WT S. mutans ولكن ليس في سلالة S. mutans gtfC-disrupted(S. mutans ΔgtfC)5 . يتم استعادة تشكيل Biofilm في S. mutans ΔgtfC على إضافة خارجية من GTF-SI المؤتلف. سلالة، S. mutans له-gtfC، ثم يستخدم لإنتاج المؤتلف GTF-SI.

Protocol

ملاحظة: يجب إكمال توليد S. mutans ‹gtfC، الذي يتم استبدال منطقة الترميز بأكملها من الجين gt fC مع sPCr، قبل تنفيذ هذه البروتوكولات. راجع المقالة المنشورة للحصول على تفاصيل حول الجيل5. 1. تصميم التمهيدي 2. إعداد التمهيديات لبناء …

Representative Results

ويبين الشكل 3 حجم كل أمبير يكون من ثاني PCR(الشكل 3ألف)وPCR الثاني(الشكل 3B). ويتوافق حجم كل أمبير مع الحجم المتوقع، على النحو المبين في الجدول 1. ويبين الشكل 4A مستعمرات S. mutans التي تحولت مع المنتج PCR ا…

Discussion

تصميم التمهيديات هو الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول. تم تحديد تسلسل gtfC-عكس وSPCR-إلى الأمام التمهيديات تلقائيا على أساس تسلسل كل من منطقة نهاية 3′ من GTFC والمنطقة نهاية 5′ من sPCr. كل التمهيدي يتضمن 24 قواعد تكميلية التي ترميز رابط GS وتسلسل له العلامة الترميز في …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد دعمت هذا العمل الجمعية اليابانية لتعزيز العلم (رقم المنحة 16K15860 و19K10471 إلى T.M., 17K12032 to M.I., and 18K09926 to N.H.) ومؤسسة SECOM للعلوم والتكنولوجيا (رقم المنحة 2018.09.10 No. 1).

Materials

Agarose Nippon Genetics NE-AG02 For agarose gel electrophoresis
Anaeropack Mitsubishi Gas Chemical A-03 Anaerobic culture system
Anti-His-Tag monoclonal antibody MBL D291-7 HRP-conjugated
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23227 Measurement of protein concentration
Brain heart infusion broth Becton, Dickinson 237500 Bacterial culture medium
CBB R-250 Wako 031-17922 For biofilm staining
Centrifugal ultrafiltration unit Sartorius VS2032 Buffer replacement and protein concentration
Centrifuge Kubota 7780II
Chromatographic column Bio-Rad 7321010 For IMAC
Dialysis membrane clamp Fisher brand 21-153-100
Dialysis tubing As One 2-316-06
DNA polymerase Takara R045A High-fidelity DNA polymerase
DNA sequencing Eurofins Genomics
ECL substrate Bio-Rad 170-5060 For western blotting
EDTA (0.5 M pH 8.0) Wako 311-90075 Tris-EDTA buffer preparation
Electroporation cuvette Bio-Rad 1652086 0.2 cm gap
Electroporator Bio-Rad 1652100
EtBr solution Nippon Gene 315-90051 For agarose gel electrophoresis
Gel band cutter Nippon Genetics FG-830
Gel extraction kit Nippon Genetics FG-91202 DNA extraction from agarose gel
Imager GE Healthcare 29083461 For SDS-PAGE and western blotting
Imidazole Wako 095-00015 Binding buffer and elution buffer preparation
Incubator Nippon Medical & Chemical Instruments EZ-022 Temperature setting: 4 °C
Incubator Nippon Medical & Chemical Instruments LH-100-RDS Temperature setting: 37 °C
Membrane filter Merck Millipore JGWP04700 0.2 µm diameter
Microcentrifuge Kubota 3740
NaCl Wako 191-01665 Preparation of binding buffer and elution buffer
NaH2PO4·2H2O Wako 192-02815 Preparation of binding buffer and elution buffer
NaOH Wako 198-13765 Preparation of binding buffer and elution buffer
(NH4)2SO4 Wako 015-06737 Ammonium sulfate precipitation
Ni-charged resin Bio-Rad 1560133 For IMAC
PCR primers Eurofins Genomics Custom-ordered
Protein standard Bio-Rad 161-0381 For SDS-PAGE and western blotting
Solvent filtration apparatus As One FH-1G
Spectinomycin Wako 195-11531 Antibiotics; use at 100 μg/mL
Sterile syringe filter Merckmillipore SLGV004SL 0.22 µm diameter
Streptococus mutans ΔgtfC Stock strain in the lab. gtfC replaced with spcr
Streptococus mutans UA159 Stock strain in the lab. S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain
Sucrose Wako 196-00015 For biofilm development
TAE (50 × ) Nippon Gene 313-90035 For agarose gel electrophoresis
Thermal cycler Bio-Rad PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) Wako 314-90065 Tris-EDTA buffer preparation

References

  1. Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).
  2. Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
  3. Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  4. Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
  5. Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
  6. Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
  7. LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
  8. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  9. Database, J. S. E. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  10. Database, J. S. E. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  11. Database, J. S. E. Gel Purification. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  12. Wingfield, P. T. Protein precipitation using ammonium sulfate. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  13. Database, J. S. E. Separating Protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  14. Database, J. S. E. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
  17. Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
  18. Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).

Play Video

Cite This Article
Murata, T., Yamashita, M., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (151), e59804, doi:10.3791/59804 (2019).

View Video