وصف هنا هو طريقة بسيطة لتنقية منتج الجينات في موتان العقدية. قد تكون هذه التقنية مفيدة في تنقية البروتينات، وخاصة بروتينات الغشاء والبروتينات الكتلية الجزيئية العالية، ويمكن استخدامها مع مختلف الأنواع البكتيرية الأخرى.
وينطوي توضيح وظيفة الجين عادة على مقارنة الصفات الفينوتية للسلالات والسلالات البرية التي تعطل فيها جين الفائدة. يتم استعادة فقدان الوظيفة بعد انقطاع الجينات في وقت لاحق عن طريق إضافة خارجية للمنتج من الجين المعطلة. وهذا يساعد على تحديد وظيفة الجين. وتنطوي الطريقة التي سبق وصفها على توليد سلالة موتان العقدية التي تعطلت في الجينات gt. هنا، يتم وصف طريقة لا تتطلب لتنقية المنتج الجيني gtfC من سلالة S. mutans التي تم إنشاؤها حديثا بعد اضطراب الجينات. هو يتضمّن الإضافة من [بولهيستيدين-كدينغ] تسلسل في ال 3′ نهاية من المورثة الفائدة, أيّ يسمح تنقية بسيطة من المورّة منتوج يستعمل محصّلة معدنة تقارب كروماتوغرافيا. لا توجد ردود فعل أنزيمية غير PCR مطلوبة للتعديل الجيني في هذه الطريقة. واستعادة المنتج الجيني عن طريق إضافة خارجية بعد تعطيل الجينات هي طريقة فعالة لتحديد وظيفة الجينات، والتي يمكن أيضا تكييفها مع الأنواع المختلفة.
وعادة ما ينطوي تحليل وظيفة الجين على مقارنة الصفات الفينوتية للسلالات البرية بالسلالات التي تعطل فيها جين الفائدة. وبمجرد إنتاج السلالة التي تعطلت الجينات، فإن الإضافة الخارجية للمنتج الجيني تسمح باستعادة وظيفية.
الطريقة الأكثر شيوعا للحصول على منتجات الجينات النقية اللازمة لتجارب الترميم اللاحقة هي عن طريق أداء التعبير غير المتجانس في الإشريكية القولونية1. ومع ذلك، فإن التعبير عن بروتينات الغشاء أو البروتينات الكتلية العالية غالبا ما يكون من الصعب استخدام هذا النظام1. في هذه الحالات، عادة ما يتم عزل البروتين المستهدف من الخلايا التي تجمع البروتين أصلا من خلال سلسلة معقدة من الخطوات، والتي قد تؤدي إلى فقدان المنتج الجيني. للتغلب على هذه القضايا، تم تطوير إجراء بسيط لتنقية المنتجات الجينية بعد طريقة تعطيل الجينات2،طريقة ربط الحمض النووي المستندة إلى PCR3 (المعينة ثنائي ونفي من خطوتين PCR)، والكهرباء للجينات التحول في موتات العقدية. إضافة علامة polyhistidine (له العلامة) إلى C-terminus من المنتج الجيني يسهل تنقية من قبل الكروماتوغرافيا المعدنية تقارب المعطلة (IMAC).
لعزل سلالة التعبير عن علاماته، يتم استبدال الحمض النووي الجينومي الكامل للجين موضع الاهتمام (في هذه السلالة التي تعبر عن الجينات التي تم التعبير عنها) بجين علامة مقاوم للمضادات الحيوية. إجراء لتوليد سلالة له العلامة التعبير عن متطابقة تقريبا لتلك التي لتوليد سلالة الجينات تعطل كما هو موضح سابقا4,5. ولذلك، ينبغي تنفيذ أساليب تعطيل الجينات وعزل المنتجات الجينية كتجارب متسلسلة للتحليل الوظيفي.
في العمل الحالي، يتم إرفاق تسلسل الترميز polyhistidine إلى نهاية 3′ من gtfC (GenBank locus tag SMU_1005) الجينات، ترميز غلوكوزيلترانسفيراز-SI (GTF-SI) في S. mutans6. ثم أجريت دراسات التعبير في الأنواع العقدية. تحقيق التعبير gt fC غير متجانسة من قبل E. القولونية من الصعب، على الأرجح بسبب الكتلة الجزيئية العالية من GTF-SI. هذه السلالة تدعى س. موتانس له-gtfC. رسم تخطيطي يصور تنظيم GTFC وspectinomycin كاسيت الجينات المقاومة(sPCr)7 loci في البرية من نوع S. mutans (S. mutans WT) وتظهر مشتقاته في الشكل 1 وGTF-SI هو بروتين إفرازي الذي يساهم في تطوير biofilm الأسنان المسببة للسرطان6. تحت وجود السكروز، لوحظ biofilm الملتصق على سطح زجاجي أملس في سلالة WT S. mutans ولكن ليس في سلالة S. mutans gtfC-disrupted(S. mutans ΔgtfC)2،5 . يتم استعادة تشكيل Biofilm في S. mutans ΔgtfC على إضافة خارجية من GTF-SI المؤتلف. سلالة، S. mutans له-gtfC، ثم يستخدم لإنتاج المؤتلف GTF-SI.
تصميم التمهيديات هو الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول. تم تحديد تسلسل gtfC-عكس وSPCR-إلى الأمام التمهيديات تلقائيا على أساس تسلسل كل من منطقة نهاية 3′ من GTFC والمنطقة نهاية 5′ من sPCr. كل التمهيدي يتضمن 24 قواعد تكميلية التي ترميز رابط GS وتسلسل له العلامة الترميز في …
The authors have nothing to disclose.
وقد دعمت هذا العمل الجمعية اليابانية لتعزيز العلم (رقم المنحة 16K15860 و19K10471 إلى T.M., 17K12032 to M.I., and 18K09926 to N.H.) ومؤسسة SECOM للعلوم والتكنولوجيا (رقم المنحة 2018.09.10 No. 1).
Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
Centrifuge | Kubota | 7780II | |
Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
(NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |