Zuivering van een hoog molecuulmassa-eiwit in Streptococcus mutans
Summary
Hier beschreven is een eenvoudige methode voor de zuivering van een genproduct in Streptococcus mutans. Deze techniek kan voordelig zijn bij de zuivering van eiwitten, met name membraan eiwitten en hoge moleculaire massa-eiwitten, en kan worden gebruikt met verschillende andere bacteriesoorten.
Abstract
De Elucidatie van de functie van een gen impliceert doorgaans een vergelijking van fenotypische eigenschappen van wild type stammen en stammen waarin het gen van belang is verstoord. Verlies van functie na genverstoring wordt vervolgens hersteld door exogene toevoeging van het product van het verstoorde gen. Dit helpt om de functie van het gen te bepalen. Een eerder beschreven methode omvat het genereren van een Gtfc gen-verstoorde Streptococcus mutans stam. Hier wordt een niet-veeleisende methode beschreven voor het zuiveren van het Gtfc -genproduct uit de nieuw gegenereerde S. mutans -stam na de verstoring van het gen. Het gaat om de toevoeging van een sequentie van polyhistidine-Coding aan het 3 ′ uiteinde van het gen van belang, waardoor eenvoudige zuivering van het genproduct met behulp van geïmmobiliseerde metaal affiniteits chromatografie mogelijk is. Voor de genetische modificatie in deze methode zijn geen andere enzymatische reacties nodig dan PCR. Het herstel van het genproduct door exogene toevoeging na gendisruptie is een efficiënte methode voor het bepalen van de genfunctie, die ook kan worden aangepast aan verschillende soorten.
Introduction
Analyse van de functie van een gen impliceert meestal een vergelijking van fenotypische eigenschappen van wild-type stammen tot stammen waarin het gen van belang is verstoord. Zodra de door het gen verstoorde stam wordt geproduceerd, maakt exogene toevoeging van het genproduct een functioneel herstel mogelijk.
De meest voorkomende methode voor het verkrijgen van gezuiverde genproducten die nodig zijn voor daaropvolgende restauratie testen is door heterologeuze expressie in Escherichia coli1uit te voeren. Echter, de expressie van membraan eiwitten of hoge moleculaire massa eiwitten is vaak moeilijk met behulp van dit systeem1. In deze gevallen wordt het doeleiwit meestal geïsoleerd van de cellen die het eiwit native synthetiseert door middel van een complexe reeks stappen, wat kan leiden tot verlies van het genproduct. Om deze problemen op te lossen, is een eenvoudige procedure ontwikkeld voor genproduct zuivering na een gendisruptie methode2, PCR-gebaseerde DNA-splicing methode3 (aangewezen twee-STELE fusie-PCR) en elektroporation voor genetische transformatie in Streptococcus mutans. Toevoeging van een polyhistidine tag (his-tag) aan het C-eindpunt van het genproduct vergemakkelijkt de zuivering ervan door geïmmobiliseerde metaal affiniteits chromatografie (IMAC).
Om de zijn-tag-uitverwoorde stam te isoleren, wordt het gehele genomische DNA van het gen van belang (in deze zijn-tag-uitverwoorde gen-verstoorde stam) vervangen door een antibioticum-resistent marker gen. De procedure voor het genereren van de his-tag-uitdrukken van strainis bijna identiek aan die voor het genereren van een genverstoorde stam zoals eerder beschreven4,5. Daarom moeten de methoden voor gendisruptie en genproduct isolatie worden uitgevoerd als seriële experimenten voor de functionele analyse.
In het huidige werk, een polyhistidine-Coding sequentie wordt gehecht aan het 3 ′ uiteinde van de Gtfc (GenBank Locus tag SMU_1005) gen, codering glucosyltransferase-si (GTF-si) in S. mutans6. Vervolgens werden expressie studies in een streptokokken soort uitgevoerd. Het bereiken van heterologe gtfc expressie door E. coli is moeilijk, waarschijnlijk vanwege de hoge moleculaire massa van GTF-si. Deze stam heeft de naam S. mutans his-gtfc. Een schematische illustratie van de organisatie van de gtfc en spectinomycine resistentie gen cassette (SPCr)7 loci in wild-type S. mutans (s. mutans WT) en derivaten daarvan wordt weergegeven in Figuur 1. De GTF-SI is een secretoire proteïne dat bijdraagt aan de ontwikkeling van de cariogene dentale biofilm6. Onder de aanwezigheid van sucrose wordt een aanhandige biofilm waargenomen op een glad glazen oppervlak in WT s. mutans stam maar niet in de S. mutans gtfc-verstoorde stam (S. mutans Δgtfc)2,5 . Biofilm vorming wordt hersteld in S. mutans Δgtfc op exogene toevoeging van de RECOMBINANT GTF-si. De stam, S. mutans zijn-gtfc, wordt vervolgens gebruikt voor de productie van de RECOMBINANT GTF-si.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het ontwerp van primers is de meest kritieke stap in het protocol. De sequenties van de gtfc-reverse en SPCr-forward primers werden automatisch bepaald op basis van de sequenties van zowel het 3 ′ eindgebied van gtfc als het 5 ′ eindgebied van SPCr. Elke primer bevat 24 complementaire basissen die coderen een GS linker en een zijn-tag-coding sequentie in hun 5 ‘ regio’s. Verstoring van de inheemse regelgevings sequenties gelegen in de upstream flankerende regi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (subsidie nummers 16K15860 en 19K10471 tot T. M., 17K12032 tot M. I., en 18K09926 tot N. H.) en de SECOM Science and Technology Foundation (subsidie nummer 2018.09.10 nr. 1).
Materials
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
- Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Database, J. S. E. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. Gel Purification. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Wingfield, P. T. Protein precipitation using ammonium sulfate. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
- Database, J. S. E. Separating Protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
