In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy In Vivo
Summary
L’imagerie optique transcrânienne permet l’imagerie à large champ du transport du liquide céphalo-rachidien dans le cortex des souris vivantes à travers un crâne intact.
Abstract
Le flux de fluide céphalo-rachidien (CSF) chez les rongeurs a été largement étudié à l’aide de la quantification ex vivo des traceurs. Des techniques telles que la microscopie à deux photons et l’imagerie par résonance magnétique (IRM) ont permis une quantification in vivo du flux de FSC, mais elles sont limitées par des volumes d’imagerie réduits et une faible résolution spatiale, respectivement. Des travaux récents ont constaté que CSF pénètre dans le parenchyme cérébral à travers un réseau d’espaces périvasculaires entourant les artères piales et pénétrantes du cortex des rongeurs. Cette entrée périvasculaire de CSF est un moteur primaire du système glymphatique, une voie impliquée dans le dégagement des solutés métaboliques toxiques (par exemple, amyloïde-MD). Ici, nous illustrons une nouvelle technique d’imagerie macroscopique qui permet l’imagerie en temps réel et mésoscopique des traceurs fluorescents de CSF par le crâne intact des souris vivantes. Cette méthode peu invasive facilite une multitude de conceptions expérimentales et permet des tests uniques ou répétés de la dynamique du FSC. Les macroscopes ont une résolution spatiale et temporelle élevée et leur grande distance de portique et de travail permet l’imagerie tout en effectuant des tâches sur des dispositifs comportementaux. Cette approche d’imagerie a été validée à l’aide de mesures d’imagerie à deux photons et de fluorescence obtenues à partir de cette technique fortement corrélées avec la fluorescence ex vivo et la quantification des traceurs radio-étiquetés. Dans ce protocole, nous décrivons comment l’imagerie macroscopique transcrânienne peut être utilisée pour évaluer le transport glymphatique chez les souris vivantes, offrant une alternative accessible aux modalités d’imagerie plus coûteuses.
Introduction
Le liquide céphalo-rachidien (CSF) baigne le cerveau et la moelle épinière et est impliqué dans le maintien de l’homéostasie, l’approvisionnement en nutriments, et la régulation de la pression intracrânienne1. CSF dans l’espace subarachnoïde pénètre dans le cerveau à travers un réseau d’espaces périvasculaires (PVS) entourant les artères corticales piales, puis coule vers le bas le long des artérioles pénétrantes2. Une fois dans le parenchyme, Le CSF échange avec le liquide interstitiel (ISF), transportant des métabolites nocifs tels que l’amyloïde et les agrégats de protéines tau hors du cerveau par des voies de matière blanche à faible résistance et des espaces pereux2,3 . Cette voie dépend des canaux astroglial d’aquaporine-4 (AQP4) et a donc été appeléele système glil-lymphatique (glymphatique) 4. Les déchets du neuropil sont finalement éliminés du CSF-ISF par des vaisseaux lymphatiques près des nerfs crâniens et dans les méninges vers les ganglions lymphatiques cervicaux5. L’échec de ce système a été impliqué dans plusieurs maladies neurologiques telles que la maladie d’Alzheimer6,7, traumatisme crânien3, et l’AVC ischémique et hémorragique8.
Le transport De CSF peut être visualisé en infusant des traceurs dans la magna de cisterna (CM)9,10 et les études glymphatiques dans le passé ont principalement utilisé la microscopie de deux photons4,11,12, 13, imagerie par résonance magnétique (IRM)14,15,16,17, et ex vivo imagerie3,6,11, 18 pour évaluer la cinétique des traceurs. La microscopie à deux photons est une méthode appropriée pour l’imagerie détaillée des traceurs de CSF dans les PVS et le parenchyme en raison de sa haute résolution spatiale, cependant, il a un champ de vision étroit et nécessite une fenêtre crânienne envahissante ou l’amincissement du crâne. L’imagerie ex vivo, en combinaison avec l’immunohistochimie, permet des analyses à plusieurs niveaux allant des cellules individuelles jusqu’à l’ensemble du cerveau19. Cependant, le processus de perfusion-fixation qui est nécessaire pour observer le tissu post-mortem produit des changements profonds dans la direction de flux de CSF et s’effondre le PVS, modifiant considérablement la distribution et l’emplacement des traceurs12. Enfin, tandis que MRI peut suivre le flux de CSF dans l’ensemble du cerveau murine et humain, il manque de résolution spatiale et temporelle du flux périvasculaire.
Une nouvelle technique, l’imagerie macroscopique transcrânienne, résout certaines de ces limitations en permettant l’imagerie à large champ du transport périvasculaire de CSF dans le cortex dorsal entier des souris vivantes. Ce type d’imagerie est fait avec un macroscope épifluorescent utilisant un cube de filtre multibande, source de lumière LED réglable, et caméra CMOS à haut rendement10. Ces configurations sont capables de résoudre pvS jusqu’à 1-2 mm sous la surface du crâne et peuvent détecter les fluorophores jusqu’à 5-6 mm sous la surface corticale tout en laissant le crâne entièrement intact10. Les filtres multibandes et les LED qui peuvent rapidement régler la longueur d’onde de l’excitation permettent l’utilisation de fluorophores multiples permettant à CSF d’être étiqueté avec des traceurs de différents poids moléculaires et propriétés chimiques dans la même expérience.
Cette procédure nécessite une chirurgie simple et mini-invasive pour exposer le crâne et placer une plaque de tête légère pour stabiliser la tête pendant la séance d’imagerie. Les traceurs peuvent être livrés dans le CM sans percer dans le crâne ou pénétrer le tissu cortical avec des pipettes ou des canules9,20. Les canules CM et les plaques de tête restent stables pendant plusieurs jours à plusieurs semaines et facilitent des conceptions expérimentales plus complexes par rapport à la visualisation classique de point final. Ce protocole décrit comment la formation image macroscopique transcrânienne est employée pour étudier la fonction glymphatique de système suivant l’injection aigue ou chronique du traceur fluorescent de CSF dans le CM des souris anesthésiées/dormantes ou éveillées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons décrit un protocole détaillé pour exécuter la formation image transcrânienne de CSF dans les souris vivantes utilisant les macroscopes et les traceurs fluorescents commercialement disponibles. Cette technique est simple et peu invasive, mais quantitative. L’imagerie in vivo est bien corrélée avec des méthodes sensibles telles que le comptage de la scintillation liquide des traceurs étiquetés par radio, y compris 3H-dextran et 14C-inuline après la livraison de CM, et avec la qua…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke et le National Institute on Aging (US National Institutes of Health; R01NS100366 et RF1AG057575 à MN), le Programme des réseaux transatlantiques d’excellence de la Fondation Leducq et le programme de recherche et d’innovation DE l’UE Horizon 2020 (subvention no 666881; SVDs-target). Nous tenons également à remercier Dan Xue pour son aide experte en illustrations graphiques.
Materials
| 0.25% Bupivacaine HCl | University of Rochester Vivarium | ||
| 100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| A-M Systems Dental Cement Powder | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
| Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
| CMOS Camera | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Head Plate | University of Rochester | No catalog # | Custom made at the machine shop at the University of Rochester |
| High-Temperature Cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Isoflurane – Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | No catalog #, see link in comments | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 – Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| Simple Head Holder Plate (for mice) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Single-use Needles, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Xylazine | University of Rochester Vivarium |
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