В Vivo Изображение цереброспинальной жидкости транспорт через Череп мыши Intact с помощью флуоресценции Макроскопия
Summary
Транскраниальная оптическая визуализация позволяет широкополевую визуализацию спинномозговой жидкости переноса в коре живых мышей через нетронутый череп.
Abstract
Спинномозговая жидкость (CSF) поток у грызунов в значительной степени были изучены с помощью ex vivo количественной оценки трассаторов. Такие методы, как двухфотонная микроскопия и магнитно-резонансная томография (МРТ), позволили ввиво количественно осваить поток CSF, но они ограничены уменьшением объемов изображений и низким пространственным разрешением, соответственно. Недавняя работа показала, что CSF входит в мозг паренхимы через сеть периваскулярных пространств, окружающих pial и проникающих артерий коры грызунов. Этот периваскулярный вход CSF является основным фактором глимфатической системы, пути, замешанного в очистке токсичных метаболических растворов (например, амилоида-Я). Здесь мы иллюстрируем новый макроскопический метод визуализации, который позволяет в режиме реального времени, мезоскопические изображения флуоресцентных трассаторов CSF через нетронутый череп живых мышей. Этот минимально инвазивный метод облегчает множество экспериментальных конструкций и позволяет однократное или повторное тестирование динамики CSF. Макроскопы имеют высокое пространственное и временное разрешение, а их большое гантри и рабочее расстояние позволяют выполнять изображения при выполнении задач на поведенческих устройствах. Этот подход к визуализации был проверен с помощью двухфотонных изображений и измерений флуоресценции, полученных из этой техники, которые сильно коррелируют с флуоресценцией ex vivo и количественной оценкой радиомаркированных трассировок. В этом протоколе мы описываем, как транскраниальные макроскопические изображения могут быть использованы для оценки глимфатического переноса у живых мышей, предлагая доступную альтернативу более дорогостоящим методам визуализации.
Introduction
Цереброспинальная жидкость (CSF) купает мозг и спинной мозг и участвует в поддержании гомеостаза, поставки питательных веществ и регулирования внутричерепного давления1. CSF в субарахноидальном пространстве входит в мозг через сеть периваскулярных пространств (PVS) окружающих корковых pial артерий, а затем течет вниз по проникающим артериолям2. Оказавшись в паренхиме, CSF обменивается с интерстициальной жидкостью (ISF), несущей вредные метаболиты, такие как амилоидные (АЗ) и тау-протеины агрегаты из мозга через низкое сопротивление белого вещества трактов и перипетие пространства2,3 . Этот путь зависит от астроглиальных aquaporin-4 (АЗП4) каналов и, следовательно, был назван глиально-лимфатической (глимфатической) системы4. Отходы продуктов нейропила в конечном счете, очищается от CSF-ISF через лимфатические сосуды вблизи черепных нервов и в очернениях к шейки лимфатических узлов5. Отказ этой системы был замешан в нескольких неврологических заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера6,7, черепно-мозговая травма3, и ишемический и геморрагический инсульт8.
CSF транспорт может быть визуализирован путем вливание трассаторов в цистерны Magna (CM)9,10 и глимфатические исследования в прошлом в основном использовали два фотона микроскопии4,11,12, 13, магнитно-резонансная томография (МРТ)14,15,16,17,и ex vivo изображений3,6,11, 18 для оценки трассикккин кинетики. Двухфотонная микроскопия является подходящим методом для детальной визуализации трассаторов CSF в PVS и паренхимы из-за его высокого пространственного разрешения, однако, он имеет узкое поле зрения и требует инвазивного черепного окна или истончение черепа. Ex vivo визуализации, в сочетании с иммуногистохимии, позволяет многоуровневый анализ, начиная от одиночных клеток до всего мозга19. Тем не менее, процесс перфузии-фиксации, которая необходима для наблюдения посмертной ткани производит глубокие изменения в направлении потока CSF и разрушает PVS, значительно изменяя распределение и расположение трассировок12. Наконец, в то время как МРТ может отслеживать поток CSF по всему мурин и человеческого мозга, ему не хватает пространственного и временного разрешения периваскулярного потока.
Новая методика, транскраниальная макроскопическая визуализация, решает некоторые из этих ограничений, позволяя широкое поле изображения периваскулярного переноса CSF во всей коре дорсальной коры живых мышей. Этот тип изображения делается с эпифлуоресцентным макроскопом с использованием многополосного фильтра куба, tunable светодиодный источник света, и высокоэффективная камера CMOS10. Эти установки способны решать PVSs до 1-2 мм ниже поверхности черепа и может обнаружить фторфоры до 5-6 мм ниже корковой поверхности, оставляя череп полностью нетронутыми10. Многополосные фильтры и светодиоды, которые могут быстро настроить волнообразную длину возбуждения, позволяют использовать несколько фторофоров, позволяющих маркировать CSF трассирами различных молекулярных весов и химических свойств в одном эксперименте.
Эта процедура требует простой, минимально инвазивной хирургии, чтобы разоблачить череп и поместить леглегчайшую головную пластину, чтобы стабилизировать голову во время сеанса визуализации. Трассы могут быть доставлены в CM без бурения в череп е или проникать в корковую ткань пипетками или канюлями9,20. Оба канюли CM и головные пластины остаются стабильными в течение нескольких дней до нескольких недель и облегчить более сложные экспериментальные проекты по сравнению с классической визуализации конечных точек. Этот протокол описывает, как транскраниальная макроскопическая визуализация используется для изучения функции глимфатической системы после острой или хронической инъекции флуоресцентного трассировщика CSF в CM анестезиозных/спящих или бодрствуенных мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описали подробный протокол для выполнения транскраниальных csF изображений у живых мышей с использованием коммерчески доступных флуоресцентных макроскопов и трассаторов. Этот метод прост и минимально инвазивный, но количественный. In vivo изображений хорошо коррелирует с чувствитель…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта и Национальным институтом по проблемам старения (Национальные институты здравоохранения США; R01NS100366 и RF1AG0575775 до MN), Фонд Leducq Трансатлантические сети передового опыта программы, и ЕС Горизонт 2020 научно-исследовательской и инновационной программы (грант No 666881; SVDs-target). Мы также хотели бы поблагодарить Дэна Сюэ за экспертную помощь с графическими иллюстрациями.
Materials
| 0.25% Bupivacaine HCl | University of Rochester Vivarium | ||
| 100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| A-M Systems Dental Cement Powder | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
| Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
| CMOS Camera | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Head Plate | University of Rochester | No catalog # | Custom made at the machine shop at the University of Rochester |
| High-Temperature Cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Isoflurane – Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | No catalog #, see link in comments | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 – Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| Simple Head Holder Plate (for mice) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Single-use Needles, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Xylazine | University of Rochester Vivarium |
References
- Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers – anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
- Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner’s Guide. Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).
- Da Mesquita, ., S, , et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer’s disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Gaberel, T., et al. Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis. Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (23), (2018).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
- Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System. in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).
- Davoodi-Bojd, E., et al. Modeling glymphatic system of the brain using MRI. Neuroimage. 188, 616-627 (2019).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), (2019).
- Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. The glymphatic pathway in neurological disorders. The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. Elife. 7, (2018).
- Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7, 11100 (2016).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ren, Z., et al. Hit & Run’ model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system. The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).
- Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
- Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice. Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).
