والهدف من هذه المادة هو الخطوط العريضة للخطوات اللازمة لتوليد الفيفيلز من مونوميريك الفا-synuclein ، ومراقبه الجودة اللاحقة ، واستخدام ألياف الليفية التي تم تشكيلها في الجسم المجري.
استخدام في الجسم الفيفو الفا synuclein بريفورماين (α-syn PFF) نموذج من اعتلال النواة تكتسب شعبيه بين الباحثين تهدف إلى نموذج مرض باركنسون داء النيونوستريفاتال وانحطاط القرنية. توحيد الجيل α-syn PFF وفي تطبيق الجسم الحيوي أمر بالغ الاهميه من أجل ضمان متسقة وقويه α syn الامراض. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتوليد ألياف الليفية من مونواريك α-syn ، وخطوات التحكم في الجودة بعد الحقن ، والمعلمات المقترحة للحقن الجراحي العصبي الناجح لل α-syn الغدد الصم في الفئران أو الفئران. بدءا من موحودي α-syn ، يحدث الليفي علي مدي فتره حضانة لمده 7 أيام اثناء الاهتزاز في ظروف العازلة الأمثل ، والتركيز ، ودرجه الحرارة. يتم تقييم التحكم في الجودة بعد التشكيل الليفي من خلال وجود ألياف الليفية القابلة للتكوير عن طريق فحص الترسب ، وتكوين اميلويد في الفيفيلز مع فحص ثيوفلافين T ، والتصور المجهري الكترون للفيفيلز. في حين ان التحقق من صحة ناجحه باستخدام هذه المقايسات ضروري للنجاح ، فانها ليست كافيه لضمان سيتم البذور الشوائب α-syn في الخلايا العصبية ، كما ينبغي اختبار هذا النشاط التجميع من كل دفعه PFFS في ثقافة الخلية أو في الأفواج الحيوانية الرائدة. قبل الاستخدام ، يجب ان تكون الفحوصات بالرنين الضوئي تحت ظروف قياسيه بدقه ، تليها الفحص باستخدام المجهر الكتروني أو تشتت الضوء الديناميكي لتاكيد أطوال الفيريل ضمن نطاق الحجم الأمثل ، مع متوسط طول 50 نانومتر. ويمكن بعد ذلك أضافه PFFs إلى وسائل الاعلام الثقافة الخلية أو استخدامها في الحيوانية. علم الامراض التي يمكن كشفها عن طريق المناعية ل α-syn (بسينون ؛ سيرين 129) هو واضح أيام أو أسابيع في وقت لاحق في ثقافة الخلية ونماذج القوارض ، علي التوالي.
مرض باركنسون (PD) ويتميز في المقام الأول بعد الوفاة من قبل اثنين من السمات المرضية الرئيسية: علي نطاق واسع والتقدمي الفا synuclein (α-syn) علم الامراض ، وانحطاط نيجروسترياتال. بعد الحقن في الفئران البرية أو الفئران ، α-syn ألياف الليفية بريفورميد (pffs) الحث علي التراكم التدريجي لل α-syn المرضية ، والتي يمكن ان تؤدي إلى انحطاط طويل الأمد من المكونات السوداء التي الخلايا العصبية الدوبامين (snpc) علي مدي العديد من أشهر ، فضلا عن العجز حسي1،2،3،4،5،6. وتتعرض الخلايا العصبية للفينيات α-syn ، اما عن طريق الحقن المباشر داخل المخ أو أضافه إلى وسائل الاعلام من الخلايا العصبية المستزرعة. عندما يتم أخذها في الخلايا العصبية ، والقانون pffs إلى “البذور” تشكيل الشوائب من خلال القولبة ، وتراكم α-syn الذاتية في الشوائب الفوسفروتيلاتيد1،7،8، 9-الآن تتضمن الشوائب خصائص متشابهة لأجساد لوي: تحتوي علي α-syn الفوسفارلاتيد في سيرين 129 (بسينون) ، اوبيكويتين ، و p62 ؛ تمتلك الهياكل الرباعية اميلويد كما هو مبين مع تلطيخ ثيوفلافين الايجابيه ؛ ومقاومه ل بروتيداز ك الهضم1،3،5،7،8،9،10،11، 12-الآن يؤدي التعرض pff إلى تكوين α-syn في المرحلة الابتدائية وبعض الخلايا العصبية الخلده في الثقافة ، فضلا عن الفئران والجرذان والرئيسيات غير البشرية في فيفو1،2،3،4، 5،6،7،8،9،13. من المهم ان نلاحظ ان الخلايا العصبية الدقيقة لن تؤدي إلى تكوين الفا syn في جميع نماذج ثقافة الخلية وبعض الخلايا العصبية مثقف سوف البذور أفضل من غيرها.
ومن السمات الهامه الأخرى للنموذج المجري α-syn PFF المراحل المرضية المتسلسلة المتميزة التي تظهر علي مدي عده أشهر. في القوارض, بعد حقن إينتراسترياتال, الفا-syn التضمين تشكيل قمم عموما داخل SNpc والعديد من المناطق القشرية في غضون 1-2 أشهر. ويلي هذا التراكم الذروة بواسطة الضمور ال≈ 2-4 أشهر في وقت لاحق1,3,5. هذه المراحل المرضية متميزة توفر للباحثين المنصة التي لدراسة وتطوير الاستراتيجيات التي 1) إنقاص α-syn التجميع ، 2) واضحة شكلت بالفعل الشوائب α-syn ، و/أو 3) منع الضمور العصبي اللاحقة. نموذج PFF يقدم مزايا متميزة وعيوب بالمقارنة مع السمية العصبية ، المعدلة وراثيا ، وناقلات الفيروسية توسط α-syn نماذج التعبير الفوقي كما سبق مراجعتها6. وينبغي تحديد النموذج أو النهج الذي سيتخذه النموذج الأنسب الذي يناسب السؤال الذي يطرحه المحققون.
علي الرغم من ان نموذج PFF قد استخدمت بنجاح من قبل العديد من المختبرات ، لا تزال هناك مجموعات التي شهدت عدم الاتساق مع توليد الفيفيلز وإنتاج متسقة α-syn الامراض14. أمثله من التناقضات تتراوح بين التي تنتج القليل أو لا الامراض α-syn ، دفعه لكفاءة البذر دفعه ، وحتى فشل الفيفيلز لتشكيل. التالي ، فان توحيد الجيل α-syn PFF وفي تطبيق الجسم الحيوي أمر بالغ الاهميه من أجل السماح لتفسيرات دقيقه فيما يتعلق بتاثير التدخلات العلاجية الجديدة. يحدد البروتوكول التالي الخطوات المطلوبة لتوليد الوحدات الخاصة من مونومرات α-syn ، ومراقبه الجودة في المختبر من PFFs شكلت مره واحده ، سونيكيشن وقياس PFFs قبل الاستخدام ، واقتراحات لتسهيل ناجحه في حقن الجسم الاصطناعي من في الفئران أو الفئران.
إنتاج α-syn PFFs قادره علي بذر الخلايا العصبية والتي تؤدي إلى الشوائب مثل الجسم لوي يعتمد علي عوامل متعددة وخطوات. والعامل الحاسم هو ان مونومرات المستخدمة لتوليد ألياف الليفية تحتاج إلى ان تصاغ خصيصا لالفيسيليشن4،9،14،15. إذا لم يتم وضع مونومرات لليفي ، قد لا تشكل الفيفيلز أو الفيفيلز التي لا تشكل قد لا تنتج α-syn علم الامراض. المثل ، فان العازلة التي مونومرات هي أيضا في التاثير علي ألياف الليفية. علي هذا النحو ، للحصول علي أفضل النتائج ، يجب ان يكون تركيز الملح حوالي 100 مم كلوريد الصوديوم ودرجه الحموضة بين 7.0 و 7.3. الخطوة الاوليه التي تقدم التغير هي الطريقة التي يتم بها تحديد محتوي البروتين الاولي ، مع القياس في A280 من المرجح ان تنتج نتائج أكثر دقه التالي هي الطريقة المفضلة. التباين في تركيز البروتين يمكن ان يقلل من فعاليه عمليه الفيسيليشن ، فضلا عن تغيير تركيز PFF المفترضة المستخدمة في التجارب. كلاهما يمكن ان يؤدي إلى انخفاض في كفاءه البذر والتباين دفعه بين التجارب.
ستؤكد الخطوات الاوليه لمراقبه الجودة السمات الحاسمة لل PFFs ، علي وجه التحديد ان لديهم التشكيل الليفي (المجهر الكترون) ، وتحتوي علي هياكل اميلويد (ثيوفلافين T الفحص) ، وهي التكوير (الترسيب المقايسة). من المهم ان نلاحظ ان نتائج الفحص ثيوفلافين T سوف تتقلب مع الوقت وليست مقياسا مباشرا لكميه الهياكل اميلويد الحاضر ، بدلا من ذلك ، يجب ان تستخدم المقايسة ثيوفلافين T فقط كمؤشر علي وجود هياكل اميلويد داخل العينة. وعاده ما يستخدم ثيوفلافين T في اختبارات في المختبر ، مثل الفحص المذكور أعلاه لإظهار الفيفيلز تحتوي علي هياكل اميلويد. بدلا من ذلك ، يتم استخدام ثيوفلافين S في الانسجه للكشف عن الهياكل اميلويد ، كما هو مبين في الشكل 7. في ما يتعلق ب ال ترسيب فحص, يبدي النتيجات فقط ان ال [بفس] يكون أسست غالبا في الكسر [بليتبل]. كما يتم تشغيل العينات في ظروف التعتيم ، وهي فرقه واحده بارزه من حوالي 14 كده ، وحجم α-syn مونومرات ، موجودة علي الهلام. وهذا علي عكس النطاقات المتعددة الموجودة في الأوزان الجزيئية العالية التي من المتوقع مع PFFs إذا تم استخدام هلام الأصلي أو غير ديكاترينغ. وأخيرا ، فان النجاح في اجتياز جميع هذه الخطوات الاوليه لمراقبه الجودة لا يضمن النشاط البذر α-syn التضمين. ولهذا السبب ، ينبغي استخدام تجارب استزراع الخلايا أو مجموعه صغيره من الحيوانية المحقونة جراحيا لاختبار فعاليه ال PFFs قبل استخدامها في تجارب أكبر.
صوتنه هو خطوه حاسمه في عمليه وسوف تختلف المعلمات اعتمادا علي نموذج sonicator المستخدمة. يجب تطبيق المعلمات صوتنه والتحقق منها لإظهار ان شظايا PFF قصيرة قد تم إنتاجها. وقد تحمل حجم الفيريل علي البذر ، مع أقصر البذر الفيفيلز أكثر كفاءه. علي الرغم من أقصر البذور الفيفيلز أكثر كفاءه ، وهذا التاثير الهضاب وطول pff الأمثل هو تقريبا 50 nm4،18. ومن المهم أيضا عدم الإفراط في النظر في العينات وفضح الحرارة المفرطة ، لان هذا قد يقلل من كفاءه البذر. وينبغي اختبار هذه pffs سونيكاتيد لفعالية في ثقافة الخلايا الصغيرة أو في التجارب المجرية قبل استخدامها في التجارب علي نطاق أوسع. كما دورات سونيكيشن مختلفه لديها القدرة علي إدخال التباين, وينبغي التخطيط لمجموعات العلاج التجريبي وفقا لذلك.
عند تقديم pffs في فيفو ، وتوطين موقع (ق) الحقن والمبلغ الإجمالي pffs المستخدمة يمكن ان تؤثر علي عدد من الخلايا العصبية التي سوف تتطور الشوائب ، فضلا عن مدي الضمور العصبي7،14. الإحداثيات في البروتوكول توفر مكانا للبدء ، ولكن ينبغي اختبارها داخل المختبر لضمان المنطقة المستهدفة المرجوة يطور α-syn علم الامراض قبل استخدامها في التجارب علي نطاق واسع. إذا رغبت في ذلك ، تتبع صبغ أو الخرز الفلورسنت يمكن استخدامها كوسيلة لاختبار الاستهداف الإقليمي قبل استخدام PFFs. يختلف مقدار pffs المستخدمة في الجسم المجري بين المجموعات ، مع معظم المجموعات باستخدام ما مجموعه بين 5 إلى 20 ميكروغرام من pffs في واحد أو مقسمه بين اثنين من مواقع الحقن1،2،3،4،5 , 6 , 7 , 14. كما ان عدد من مواقع الحقن ، وموقع مواقع الحقن ، وكميه من الحقن المحقونة يمكن ان تؤثر علي نتائج وتطور اعتلال النواة ، وينبغي ان توصف نتائج المصب من المعلمات المستخدمة قبل استخدام النموذج اختبار التدخلات المحتملة أو فحص السمات الزمنيه للنموذج.
عند اختيار نموذج لاستخدامه لاختبار التداوي أو دراسة تطور المرض ، يجب اختيار النموذج المستخدم للاجابه علي أفضل الاسئله المطروحة. ليس كل النماذج سوف تمتلك بعض ملامح المرض من PD ، أو تقديم الإطار الزمني اللازم لاختبار التدخلات المحتملة. ويلخص نموذج PFF السمات الرئيسية لل PD ، مثل علم الامراض α-syn والضمور العصبي ، ويمكن ان يؤدي إلى إعاقات حركيه متواضعة. يقدم النموذج دوره زمنيه يمكن التنبؤ بها ومطوله ، حيث تشكل الشوائب أشهر قبل الضمور العصبي. وهذا يسمح للباحثين بفحص واستغلال المراحل المختلفة خلال التطور المطول لاعتلال النواة. ومن المتوقع ان يكون الاستخدام الحالي والمستقبلي للنموذج العام مفيدا في دراسة تطور المرض وتطور العلاجات الجديدة.
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا البحث بمنح من مؤسسه مايكل جي فوكس ، والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NS099416) ومعهد ويستون الدماغ.
1x Dulbecco’s phosphate buffered saline | Thermo Fisher (Gibco) | 14190144 | |
Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody | Abcam | AB184674 | |
Anti-alpha-synuclein antibody | Abcam | AB15530 | |
Bicinchonic acid | Thermo Fisher (Pierce) | PI23228 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.036″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0143 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.044″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0296 | |
Copper sulfate | Thermo Fisher (Pierce) | PI23224 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000574 | |
Eppendorf ThermoTop heated lid | Eppendorf | 5308000003 | |
Formvar/Carbon coated electron microscopy grids | Eletron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length) | Drummond | 22-326223 | |
Glass needle puller | Narishige | PC-10 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80000 | |
Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-003 | |
Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-009 | |
Orange Medical Shrink Tubing (0.021″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0152 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7543 | |
Proteinase K | Invitrogen | 25530015 | |
Qsonica 3.2 mm tip | Qsonica | 4422 | |
Qsonica Q125 sonicator | Qsonica | Q125 | |
Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892 | |
Thioflavin T | EMD Millipore | 596200 | |
ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | Genscript | L00350C | |
Uranyl acetate | Eletron Microscopy Sciences | 22400 |