דור של אלפא-סינונוקלאומין מראש בנוי ממונמרים והשימוש ב Vivo

כל השיטות הכרוכות בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת מישיגן והוועדה השימוש (IACUC). 1. היווצרות α-סינונים מראש בנוי ממונמרים (איור 1) הפשרה α-הסירוס ונומרים על הקרח, בעדינות השעיה מחדש על ידי מצליף הצינור, ו צנטריפוגה ב 15,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.הערה: יש לניסח במפורש מונומר של α-syn לפיבריזציה. רקומביננטי ונומרים ניתן לרכוש ממקורות מסחריים או שנוצר על ידי פרוטוקולים באתר4,9,14,15. אם נרכש ממקורות מסחריים, על המוצר לציין כי מונומר-התנועה הסינטטיים במיוחד לדור הפיברילס. ללא קשר אם ונומרים נרכשים או שנוצר באתר, שלבי בקרת איכות המפורטים להלן יש לבצע עם כל אצווה כדי להבטיח סיבים יצרו ויהיה זרע ביעילות לפני השימוש בניסויים. העברת supernatant לצינור נקי 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה ולהקליט את הסכום המועבר.הערה: היזהרו כדי למנוע את הגלולה, אשר, אם קיים, יהיה קטן. למדוד את ריכוז החלבון של הסופרנטנט המועבר על ידי שיטת החומציות הסטנדרטית של חומצה (BCA), או מדידת ספיגה ב 280 ננומטר עם ספקטרוסקופיה מיקרוvolume.הערה: השיטת BCA אינה מדויקת למדידה הספציפית של α-syn ויכולה להניב תוצאות בהערכת ריכוז החלבון. כתוצאה מכך, מדידת ספיגת ב280 nm היא השיטה המומלצת לקביעת ריכוז החלבון. כדי למדוד עם הטיפול BCA, בצע את פרוטוקולי BCA סטנדרטיים ולבצע עם שלוש מדלל שונות של α-syn מונומר. הצעות לדילול הן 1:25, 1:50 ו-1:100. כדי למדוד עם השיטה A280, ריק את הקורא עם מלוחים באגירה הפוספט של Dulbecco בנפח 1x (dPBS) ללא סידן ומגנזיום, עם ריכוז מלח של כ 100 מ”מ, ו-pH טווח 7.0-7.3 (טבלת חומרים). להוסיף 2 μL של דגימת לקורא ולקרוא את ספיגת ב 280 nm. השתמש בחוק בירה-למברט. כדי לקבוע ריכוז של המונמריםהערה: מקדם הכחדה ε עבור האדם α-syn הוא 5,960 m-1ס מ -1 ו עבור העכבר α-synהוא 7,450 M1ס מ -1. Pathlength נמדד ס”מ. משקל מולקולרי של α-syn (14 kDa) מוערך בהנחה 1 Da = 1 g/מול. לדלל את המונמרים עם 1x dPBS לריכוז הסופי של 5 מ”ג/mL. השתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את כמות 1x dPBS שנוספה כדי לדלל את המונמרים.הערה: כל הריכוזים נמצאים ב-mg/mL, ואמצעי אחסון ב-μL. Monomer יש לבצע עם 1x dPBS. נפח כולל המשמש ליצירת סיבים צריך להיות בין 100 ו 500 μl כדי להשיג תוצאות fibriliטיזציה. בקצרה מערבולת לערבב, ו צנטריפוגה לאסוף את כל הנוזל בתחתית הצינור. מונולינים עבור בקרת איכות השוואה עם סיבים כפי שמצוין בשלבים 1.8.1-1.8.4. השתמש במנעול צינור או שעווה/פלסטיקהסרט (טבלת חומרים) כדי לאבטח את מכסה צינורית המיקרוצנטריפוגה סגור. מניחים את הצינור בthermomixer מסלולית עם מכסה של 7 ימים ב 37 ° c, רועד ב 1,000 RPM (שולחן החומרים).הערה: בסוף 7 הימים, התכולה של השפופרת אמורה להופיע. הthermomixer חייב להיות מכסה כדי למנוע היווצרות עיבוי על מכסים הצינור. בעדינות קפיצי את הצינור כדי להשעות את הα-syn של fibrils. המאמר מיועד לשלבים הבאים של בקרת איכות כפי שמצוין בשלבים 1.8.1-1.8.4.הערה: Fibrils עבור שלבי בקרת איכות ניתן לאחסן ב RT לילה. המשך 6 μL עבור מועד הסדרת השקעי. מפרט 5 μL עבור שיטת הכריכה של האיגוד. משדר 2 μL עבור מיקרוסקופ אלקטרוני השידור עבור הדמיה של פיבריריל. מחלקים לפחות 10 μL לצורך שיטת האנדוטוקסין.הערה: לצורך שיטת האנדוטוקסין, משמש Limulus Amebocyte ליפוסט (לל) מסחרי, בעקבות הוראות היצרן (טבלת חומרים). רמות אנדוטוקסין צריך להיות ≤ 0.5 יחידות אנדוטוקסין/mL עבור fibrils. ניתן להשתמש בערכת להסרת אנטוקסין אם קריטריון זה אינו מתקיים. . מחלקים את החלקים הנותרים וחנות לאחסון ארוך טווח (12-18 חודשים), להקפיא במהירות על קרח יבש, ולאחסן ב-80 ° c.הערה: הסכום עד סדרת מחלקים תלוי ביישום הרצוי במורד הזרם. ב vivo השימוש בדרך כלל דורש סיבים יותר בריכוזים גבוהים יותר מאשר בשימוש חוץ גופית, ואמצעי אחסון סדרת מחלקים צריך להיות מתוכנן בהתאם. Fibrils צריך להיות מאוחסן לעבר החלק האחורי של המקפיא כדי למנוע נזק הקפאה/הפשרה פוטנציאליים. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. 2. משקעי שקעים בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי, להוסיף 6 μl של pff כדי 54 μl של dpbs לדלל סיבים 1:10, ו pipet לערבב. בצינור נפרד, להוסיף 6 μl של מונומר ל 54 μl של dpbs כפקד נוסף. דגימות צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 דקות at RT ולהעביר את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי. הוסף 60 μL של dPBS לגלולה הנותרים ומערבולת כדי להשעות מחדש. הוסף 30 μL של מאגר לדוגמה 3x (140 μL של 50% גליצרול/0.1% ברומרופנול כחול, 40 μL של 10% SDS, ו 20 μL של β-mercaptoethanol) לכל צינור ומערבולת לערבב. מודטה דגימות ב 100 ° c עבור 10 דקות ולאפשר קריר עבור 5 דקות על הקרח. השתמש בתקן נתרן dodecyl סולפט-פוליאקרילמיד ג’ל (SDS-PAGE) פרוטוקול כדי להפריד חלבון באמצעות מסה. השתמש סולם חלבון עם מגוון הכולל 14 kDa (הלהקה גודל צפוי עבור monomeric α-syn). להעביר את הג לתוך צלחת מכתים ולכסות את ג’ל עם כתם כחול Coomassie (0.1% Coomassie כחול מבריק, 20% מתנול על ידי נפח, ו 10% חומצה אצטית על ידי נפח ב ddH2O). דגירה עבור 3 h ב RT בעת הרעד. יוצקים את הכתם כחול Coomassie ולהוסיף מספיק destain (50% מתנול על ידי נפח, ו 10% חומצה אצטית ידי נפח ב ddH2O) כדי לכסות את ג’ל. מודטה עבור 30 דקות ב-RT בעת הטלטול. יוצקים את הכתם וחזרו על הצעד הדתמים עד שהג ברור ולהקות גלויות. לשטוף את ג’ל 3 פעמים עבור 5 דקות כל אחד על ידי טלטול ב ddH2O ו התמונה ג’ל. 3. מיקרוסקופ אלקטרוני שידור להדמיה בריל שוקלים 20 מ ג אצטט uranyl בצינור מיקרוצנטריפוגה ולהוסיף 1 מ ל ddH2O כדי לבצע 2% פתרון מימית. מערבולת עד האצטט uranyl הוא בפתרון, ולאפשר לשבת בלילה.הערה: האצטט Uranyl צריך להתבצע יום לפני הכנת דגימות עבור שידור אלקטרון מיקרוסקופ. חשיפה לאור או עצבנות יכול לגרום אצטט uranyl לזרז, ככזה, את הצינור המכיל את הפתרון אצטט uranyl צריך להיות מכוסה רדיד אלומיניום, נשמר במקום חשוך, ולא מזועזעת לאחר אצטט uranyl הוא בפתרון. להוסיף 2 μl של pff כדי 98 μl של dpbs כדי לדלל סיבים 1:50, ולאחר מכן pipet לערבב. הכנת שעווה נקייה/סרט פלסטיק (טבלה של חומרים) משטח מכוסה (כ 50 מ”מ x 50 מ”מ) על הספסל. על שעווה נקייה/סרט פלסטיק (טבלה של חומרים), להוסיף את הבאים (איור 2). הוסף 4 x 10 μL טיפות של ddH2O. הוסף 1 x 10 μL של שחרור מדולל בדגימת פיבריס או מונומר. הוסף 2 x 10 μL טיפות של 2% uranyl אצטט. השתמש מלקחיים משובח כדי להרים formvar/פחמן מצופה, רשת שידור נחושת רשת מיקרוסקופ אלקטרון (טבלת חומרים).הערה: הקפד להרים את הרשת באמצעות הקצה, הימנעות מחלק הרשת במרכז (איור 2א). אם הלקחיים לגעת הרשת, את הסרט formvar/מצופה פחמן יהיה ניזוק, הפיכת הדמיה באזור זה של הרשת בלתי אפשרי. הציפה את formvar/פחמן מצופה צד (הצד המבריק) למטה על הטיפה הראשונה של ddH2O. בעדינות להשתמש מלקחיים להחזיק את הרשת ולדחוף למטה כדי להבטיח את משטח מצופה כולו הוא במגע עם ddh2O. . תן לרשת לצוף לדקה להרים את הרשת, ומבלי לגעת החלק הרשת של הרשת, הפתיל משם את ddH2O עם נייר סינון. הציפה את הרשת לעיל על הטיפה השנייה של ddH2O עבור 1 דקות והפתיל משם ddh2o. לצוף את הרשת על הירידה של סיבים מדולל עבור 1 דקות והפתיל משם את עודפי כמו מעל. הציפה את הרשת על הטיפה הראשונה של אצטט uranyl עבור 1 דקות והפתיל משם את עודפי. הציפה את הרשת על הטיפה השנייה של אצטט uranyl עבור 1 דקות, הפתיל משם את עודפי. הציפה את הרשת כמעל הטיפה השלישית של ddH2o בקצרה והפתיל משם ddh2o. הציפה את הרשת לעיל על הירידה הרביעית של ddH2O בקצרה והפתיל משם ddh2o, להיות בטוח להסיר כמו הרבה ddh2o ככל האפשר. העבר לתיבת רשת לאחסון עד לדימות.הערה: רשתות אמורות להתייבש לפחות 5 דקות לפני הדמיה. רשתות יכולות להיות בתמונה לפחות שנה לאחר ההכנה ויש לשמור אותן בסביבה יבשה. 4. שיטת תיפלוט בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי, להוסיף 5 μl של pff כדי 245 μl של dpbs לדלל סיבים 1:50, ו pipet לערבב. הוסף 250 μL של dPBS לצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד כדי לשמש כפקד שלילי. הוסף 5 μl של מונומר ל 245 μl של dpbs כדי לשמש כבקרת המונומר. הוסף 250 μL של thioflavin T בתוך מאגר גליצין (25 μM thioflavin T, 100 מ”מ גליצין, 1% טריטון X-100, pH 8.5) לכל מדגם ולערבב בעדינות. Pipet 2 משכפל, 200 μL כל אחד, לתוך שחור 96 צלחת הבאר. לשמור על הצלחת בחושך כדי למנוע הלבנה. דגירה עבור 1 h ב RT ולקרוא את הצלחת באמצעות עירור של 450 ננומטר ופליטה של 510 nm.הערה: הקריאות של טיאופלאבין. י, לאורך זמן יש לקרוא דגימות באותו זמן דגירה. במידת הצורך, ניתן לקחת קריאות מרובות במהלך הדגירה של שעה ולהתוות לאורך זמן. 5. הSonication של α-סינונוקלאואין בנוי מראש התראה: הsonicator וכל השלבים הsonication מבוצעים במכסה התרבות כדי למנוע חשיפה לפיבריס שעשויה להיות ניקה במהלך sonication. אנשי הצוות המבצעים את הצעדים הsonication צריכים לענוד ציוד הגנה אישי, כולל כפפות, הגנת בגדים בצורת מעיל מעבדה, ומגן פנים בעוד sonicating. הסיכון של חשיפה fibril ריל יכול להיות מופחת על ידי sonicating עם sonicator הצופר הספל, המאפשר את הצינור המכיל סיבים להישאר סגור במהלך sonication. הערה: פרמטרים sonication אופטימליים של סיבים תלויים במודל של sonicator בשימוש. מסיבה זו, מיטוב מסוים יהיה צורך לבצע כדי להבטיח סיבים הם בגודל הנכון. הsonicator בשימוש ניתן למצוא בטבלת החומרים ואת הפרמטרים המתוארים מבוססים על תוצאות קודמות עם מודל זה של sonicator. הפרמטרים להלן יפעלו עבור 2-4 μg/μL של PFFs ב 200-400 μL של פתרון. מבחן sonication עם המכשיר צריך להתבצע ו סיבים ניתח כדי להבטיח את התוצאות הרצויות מושגת לפני שימוש pffs בניסויים. לצרף בקוטר 3.2 מ”מ (טבלת חומרים) לממיר, ולהגדיר את הפרמטרים sonicator כאמור להלן בשלב 5.1.1-5.1.3. הגדר משרעת ל -30%. הגדר את הדופק ל-01 01 (1 s on; 1 ביטול). . הגדר את השעה ל0:01:00הערה: 1 דקות של פעימות שווה ל-60 פולסים, ודגם זה של sonicator (טבלת חומרים) יפסיק באופן אוטומטי. עם דגמים sonicator אחרים, יש לספור את מספר הפולסים. הפשרת סיבים ב RT ולדלל עם dpbs סטרילי בשכונה תרבות.הערה: ברור 0.6 mL מיקרוצנטריפוגה צינור עובד הטוב ביותר עבור sonication ואת הריכוז fibril ריל הסופי תלוי בשימוש מיועד. תוצאות הנציג המוצג הם מתוך ריכוז fibril ריל הסופי של 4 μg/μL. נגב את המקדח של הsonicator עם רקמת מעבדה לחה עם 70% אתנול כדי לנקות את הגשוש. לטבול את הקצה של החללית ב ddH2O ו הדופק 10 פעמים כדי לנקות את הגשוש, ולאחר מכן ניגוב יבש עם רקמת המעבדה. מניחים את העצה במכשיר לתוך הצינור של fibrils מדולל, ולמקם את הקצה בתחתית הצינור. Sonicate עבור 60 פולסים (1 s on; 1 ביטול). להעביר את המקדח למעלה ולמטה במהלך כל הדופק כדי להבטיח את כל סיבים בנוזל הם sonicated. ונקי. לאחר 60 פולסים, להסיר את המקדח מן pffs, ולהוסיף 2 μl של pffs כדי 98 μl של dpbs בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי לדלל סיבים 1:50 עבור sonicated fiבריל מדידה על ידי אלקטרון מיקרוסקופ.הערה: באופן אידיאלי, קבוצת משנה קטנה של סיבים יש למדוד לפני בהזרקה vivo ומדידה מקיפה יותר של סיבים להתבצע בעת היתרי הזמן. לאחר sonication, בקצרה צנטריפוגה PFFs עבור 1 s ב 2,000 x g כדי לאסוף את כל הנוזלים מצדי הצינור.התראה: אם הצינור הופך חם למגע, להפסיק sonicating אחרי 30 פולסים, לחכות 1 דקות, ו sonicate עבור 30 הפולסים הסופיים.הערה: בזמן שsonicating, השאר את קצה המכשיר לקראת החלק התחתון של הנוזל בתחילת כל פעימה, קרוב מדי לראש הנוזל יגרום לאובדן דגימה. לטבול את הטיפ בדיקה 1% SDS ואת הדופק 10 פעמים כדי לנקות את הגשוש. הסר את העצה מ-SDS, הטבול ב-ddH2O ודופק 10 פעמים. לנגב את המקדח עם רקמת מעבדה להתייבש עם 70% אתנול, ואז לנגב את המקדח עם רקמת מעבדה יבשה. נתק את הגשוש מהממיר והחנות. נגב את כל המשטחים במכסה המנוע עם 1% SDS, ואחריו 70% אתנול.הערה: 1% sds פתרון משמש לנתק סיבים ומשטחים נקיים וציוד16. 6. מיקרוסקופ אלקטרוני שידור למדידת sonicated פיבריס הערה: אם מיקרוסקופ אלקטרוני אינו ניתן לביצוע, והוא משמש כאמצעי עקיף לפיזור האור הדינמי וניתן להשתמש בו כאמצעים עקיפים לזריעת היעילות והנפח4,14. הכינו דגימות באמצעות הפרוטוקול מתוך הסעיף “מיקרוסקופ אלקטרוני להדמיה בריל”. השתמש במיקרוסקופ אלקטרון שידור לקחת תמונה של סיבים מ 6 כדי 10 פתחי רשת שונים.הערה: התמונות צריכות להיות הגדלה מספיק גבוהה כדי למדוד את סיבים, אבל מספיק נמוך כדי לדמיין מספר מועט בו. הגדלה סופית של כ 75, 000x צריך להספיק. למדוד את אורך של תת קבוצה קטנה של לפחות 25 סיבים לפני שימוש סיבים בניסוי.הערה: ניתן לבצע בדרך כלל מדידות אלה באמצעות תוכנת הדימות המשויכת למיקרוסקופ. עבור האימות המהיר, מדידת האדם צריכה לבחור מייצג מייצגים ולחשב את הגודל הממוצע. אורך fibril ריל צריך ממוצע סביב 50 ננומטר או פחות, עם מדידה מדויקת יותר לעקוב. למדוד את האורכים של 500 + סיבים לקבלת תוצאות מקיפות יותר.הערה: תוכנת הדמיה המשויכת למיקרוסקופ ניתן להשתמש עבור מדידות fibril ריל. לחילופין, תמונות ניתן לפתוח סיבים נמדד עם תוכנה עיבוד תמונה, באמצעות סרגל קנה המידה המשויך כל תמונה כהפניה גודל שבו כדי להשוות את אורכי בריל. 7. הכנת מזרקים מותאמים אישית להכנת זכוכית לזריקות סטריאוטקטיקה (איור 3) להוסיף כ 10 מ ל של סיליטיזציה מגיב (לוח חומרים) כדי לנקות גביע 50 mL. מניחים צינורות קפילר זכוכית (אורך של 54 מ”מ; קוטר החיצוני: 0.86 מ”מ; קוטר פנימי 0.59 מ”מ) אנכית בגביע הסיליקוזציה ומאפשרים פעולת קפילר כדי למשוך את הסיליקון מגיב במעלה הצינורית דרך פתח הצינור התחתון שקוע ב . מגיב בשיטת הטבק מגיב באופן מוסף לפתח הצינור העליון שאינו מתמלא בסיליזזציה כדי למלא לחלוטין את צינור נימי הזכוכית. הסירו את הצינורות הקפילר מהסיליקון המתכלה וכבו את הקצוות הפתוחים של הצינורות על מגבת נייר כדי להסיר את הסיליקוני בצינורות. אפשר לצינורות קפילר להתייבש לפחות 8 שעות. מניחים צינור נימי זכוכית בסיליזזציה בתוך מחטים מזכוכית (שולחן חומרים). הפעל את אלמנט החימום והרשה למשקולות המצורפות למתוח את צינור נימי הזכוכית המחומם. חותכים את שפופרת נימי הזכוכית הנמשכת עם מספריים בנקודה הדק ביותר באמצע ולהסיר את מחט הזכוכית של פולר מחט זכוכית.הערה: המחט משכה הפנימי ואת הקוטר החיצוני צריך להיות כ 80 ו 100 μm, בהתאמה. מחטי זכוכית מרובים ניתן לעשות בבת אחת ומאוחסן עד מוכן לצרף למזרק זכוכית עם מחט מתכת מחוברת (שולחן חומרים). חותכים אורך של צינורות לעטוף כיווץ (קוטר הפנימי הממוצע 0.021 “ועובי הקיר הממוצע 0.001”) כדי כ 40 מ”מ עם מספריים. החלק את עטיפת הכיווץ מעל מחט המתכת של מזרק משופע של 10 μL (טבלת חומרים). השתמש להבה פתוחה חום לדבוק הכיווץ לעטוף את המחט תוך סיבוב המחט כדי להחיל חום שווה. החלק את הקצה הגדול יותר של מחט זכוכית משכה בזהירות על מחט מתכת של המזרק. חותכים אורך של צינורות לעטוף כיווץ (קוטר הפנימי הממוצע 0.036 “ועובי הקיר הממוצע 0.005”) כדי כ 40 מ”מ עם מספריים ושקופית בקפידה על מחט זכוכית חופפים את הבסיס של מחט זכוכית המחט המתכת של המזרק (שולחן של חומרים). השתמש להבה פתוחה כדי לחמם את הכיווץ לעטוף כדי לאבטח את מחט זכוכית מחט מתכת. הוסף שכבה נוספת של כווץ לעטוף כדי לאבטח את מחט הזכוכית. חותכים אורך של צינורות לעטוף כיווץ (קוטר הפנימי הממוצע 0.044 “ועובי הקיר הממוצע 0.005”) כדי כ 40 מ”מ עם מספריים ושקופית בקפידה על מחט זכוכית חופפים את הבסיס של מחט זכוכית המחט המתכת של המזרק (שולחן של חומרים). השתמש להבה פתוחה כדי לחמם את הכיווץ לעטוף כדי לאבטח את מחט זכוכית מחט מתכת. חתוך את מחט הזכוכית עם מספריים כך הטיפ הוא כ 8 מ”מ ארוך.הערה: המחט צריכה להיות ארוכה מספיק כדי למקד את אזורי המוח הרצויים (האורך הנדרש תלוי בנקודות הציון האלה). השתמש בצעדים 7.14.1-7.14.3 כדי לבדוק את המחט כדי להבטיח שאין דליפות ויש זרימה נאותה הן בנסיגה לחילוק נוזל ממחט זכוכית. מלאו מזרק בקוטר 1 מ ל עם מחט מחוברת של 26 מנות עם dH2O. הסר את הבוכנה מתכת מן המחט מותאם אישית מזרק זכוכית ולהכניס את המחט של dH2O ממולא מזרק לתוך בסיס של המזרק. הפעילו לחץ כדי לוותר על dH2O ממחט הזכוכית. בדוק את הממשק של מחט הזכוכית ואת המחט מתכת עבור דליפות ולאשר יציב dH2O זרימה.הערה: במידת הצורך, את המחט זכוכית ניתן לגזוז כדי להגביר את קלות הזרימה ושכבות נוספות של לכווץ לעטוף הוסיף לתקן כל דליפות מהבסיס של מחט זכוכית. תמלא צינור מיקרוצנטריפוגה. עם dH2o השתמש מזרק מותאם אישית מחט זכוכית לצייר dH2o. בדוק את המחט כדי לאשר נוזל נלקח לתוך המזרק וכי אין בועות.הערה: אם יש בועות או dH2O אינו נשאב לתוך המחט, זמירה את המחט יכול לעזור להקל על הלחץ. בזהירות חנות מזרק עם מחטים זכוכית מוצמד בתיבות מזרק עד הצורך ניתוחים. השתמש בשיטות של ניתוח סטריאוטקמית סטנדרטיות למסירה של PFFs בקואורדינטות ממוטבות בעכברים (אתר אחד: AP + 0.2 מ”מ ו-ML + 2.0 מ”מ מברגמה, DV-2.6 מ”מ מ-דורא) או בחולדות (שני אתרים: AP + 1.6 מ”מ ו-ML + 2.0 מ”מ מברגמה, DV-4.0 מדורא; AP + 0.1 מ”מ ו-ML + 4.2 מ”מ מברגמה, DV-5.0 מדורא)1,14,17.הערה: קואורדינטות אלה שימשו בעכברים C57BL6/C3H ו פישר 344 חולדות. כאשר משתמשים זנים אחרים, קואורדינטות צריך להיות ממוטב.