モノマーからのαシヌクレイン予備型フィブリルの生成と生体内での使用

動物を含むすべての方法は、ミシガン州立大学組織動物ケア・ユース委員会 (IACUC) によって承認されています。 1. モノマーからのαシヌクレイン予備繊維の形成 (図 1) シヌクレインモノマーを氷上で解凍し、チューブをフリックして優しく再懸濁、4° c で10分間 15000 x gで遠心分離します。注: α-syn モノマーは、fibrilization のために特別に配合されなければなりません。組換えモノマーは、商業的供給源から購入するか、またはサイト4、9、14、15のプロトコルによって生成することができる。商業的な供給源から購入された場合、製品は、α-syn モノマーが特にフィブリルの生成のためにあることを明記しなければならない。モノマーが現場で購入または生成されているかどうかにかかわらず、以下に概説する品質管理手順は、フィブリルが形成され、実験に使用する前に効率的に種子を確実にするために、各バッチで実行する必要があります。 上清をきれいな 1.5 mL マイクロ遠心チューブに移し、移された量を記録してください。注: ペレットを避けるように注意してください (存在する場合は、小さくなります)。 標準的な bicinchoninic 酸アッセイ (BCA) のいずれかによって転写された上清のタンパク質濃度を測定するか、microvolume 分光光度計で 280 nm の吸光度を測定する。注: BCA アッセイは、α-syn の特定の測定値としては正確ではなく、過大評価タンパク質濃度の結果を得ることができます。その結果、280 nm での吸光度を測定することは、タンパク質濃度を決定するために推奨される方法です。 BCA アッセイで測定するには、標準の BCA プロトコルに従い、α-syn モノマーの3つの異なる希釈を行う。推奨希釈濃度は、1:25、1:50、および1:100 です。 A280 法で測定するには、カルシウムとマグネシウムを含まない滅菌1x ダルベッコ改変のリン酸緩衝生理食塩水 (dPBS) を用いて、約 100 mM NaCl の塩濃度と pH 範囲 7.0-7.3 (材料表) をブランクにします。 2μ l のサンプルをリーダに加え、280 nm の吸光度を読み取ります。 ビール・ランバート法を用いてモノマーの濃度を測定する。注: ヒトα syn の吸光係数εは、5960 M-1cm-1 であり、マウスα-syn については 7450 m1cm-1 です。層厚は cm 単位で測定されます。α-syn (14 kDa) の分子量は 1 Da = 1 g/mol と仮定して推定される。 1倍 dPBS のモノマーを 5 mg/mL の最終濃度に希釈します。以下の式を使用して、モノマーを希釈するために追加された 1x dPBS の量を計算します。注: すべての濃度は mg/mL で、容積はμ l である。モノマー希釈は 1x dPBS で行う必要があります。細線維を生成するために使用される総容積は、再現性の fibrilization 結果を達成するために100と500μ l の間でなければならない。 簡単に混合するために渦し、チューブの底部にあるすべての液体を収集するために遠心分離する。ステップ 1.8.1-1.8.4 で示されているようなフィブリルとの品質管理比較のためのアリコートモノマー。 チューブロックまたはワックス/プラスチックフィルム (材料表) を使用して、マイクロ遠心チューブの蓋を閉じて固定します。 37° c で7日間の蓋をした軌道リアルタイムアッセイモニタリングにチューブを置き、1000 RPM で振盪する (材料のテーブル)。注: 7 日の終わりに、チューブの内容が濁って表示されるはずです。リアルタイムアッセイモニタリングは管のふたの凝縮の形成を防ぐためにふたを備えなければならない。 慎重にチューブをフリックして、α-syn 線維を再懸濁します。ステップ1.8.1 −1.8.4 に示されるような以下の品質管理ステップのためのアリコートフィブリル。注: 品質管理ステップのためのフィブリルは一晩 RT で保存することができます。 沈降アッセイ用のアリコート6μ l。 チオフラビン T 結合アッセイ用のアリコート5μ l。 フィブリル化のための透過電子顕微鏡用アリコート2μ l。 アリコートは、エンドトキシンアッセイのために少なくとも10μ l を測定する。注: エンドトキシンアッセイでは、市販のリムルス Amebocyte ライセート (ラル) が使用されており、製造元の指示 (資料の表) に従います。エンドトキシンのレベルは、フィブリルのために≤0.5 エンドトキシン単位/mL でなければなりません。この基準が満たされていない場合、エンドトキシン除去キットを使用することができます。 残りのフィブリルとアリコートを保存します。長期保管 (12-18 ヶ月) の場合は、ドライアイスを急速に凍結し、-80 ° c で保管してください。注: アリコートの量は、目的の下流アプリケーションによって異なります。インビボでの使用は、典型的には、インビトロでの使用よりも高い濃度でより多くのフィブリルを必要とし、そしてアリコート体積はそれに応じて計画されるべきである。フィブリルは、潜在的な凍結/融解の損傷を防ぐために、冷凍庫の背部の方に保存する必要があります。プロトコルはここで一時停止することができます。 2. 沈降アッセイ きれいなマイクロ遠心チューブで、プッを1:10 希釈するために dPBS の54μ l の6μ l を添加し、pipet を混合する。 別の管で、付加的な制御として dPBS の54μ l に単量体の6つのμ l を加えなさい。 RT で30分間 1万 x gでサンプルを遠心分離し、上澄みをきれいなマイクロ遠心チューブに移します。 残りのペレットに60μ l の dPBS を加え、再懸濁に渦をかけます。 30μ l の3x サンプルバッファー (140 μ l の 50% グリセロール/0.1% ブロモフェノール、40μ l の 10% SDS、および20μ l のβ-メルカプトエタノール) を各チューブと渦に加えて混ぜる。 100° c で10分間サンプルをインキュベートし、氷上で5分間冷却することができます。 タンパク質を質量別に分離するために、標準ナトリウムドデシル硫酸-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) プロトコルを使用してください。14 kDa (単量体α syn に期待されるサイズのバンド) を含む範囲のプロテインラダーを使用します。 ゲルを染色皿に移し、クマシーブルーステインでジェルを覆います (0.1% クマシーブリリアントブルー、20% メタノール量、および 10% 酢酸 ddH2)。振とうしながら3時間、RT でインキュベートします。 クマシーブルーの汚れを注ぎ、ゲルを覆うのに十分な脱色 (容積によって 50% のメタノールおよびddH のボリュームによって 10% 酢酸) を加えてください。RT で30分間インキュベートしながら振盪します。 脱色をオフに注ぎ、ゲルが明確になり、バンドが表示されるまで、脱色ステップを繰り返します。 DdH2O で振盪することにより、それぞれ5分間ゲルを3回洗浄し、ゲルを画像化する。 3. フィブリル化可視化のための透過型電子顕微鏡 マイクロ遠心チューブ中の酢酸ウラニルの 20 mg を量り、2% 水溶液を作るために ddH2O の1ml を加えます。ウラニル酢酸が溶液中になるまで渦をし、一晩座ることを許可します。注: 酢酸ウラニルは、透過電子顕微鏡用サンプルを調製する前の日に行う必要があります。光または攪拌への暴露は、酢酸ウラニルを沈殿させることができ、そのように、ウラニル酢酸溶液を含む管は、アルミニウム箔で覆われ、暗い場所に保たれるべきであり、酢酸ウラニルが溶液中になった後に振盪しない。 プッの98μ l に2μ l を加えて dPBS を1:50 希釈し、pipet を混合する。 ベンチトップにきれいなワックス/プラスチックフィルム (材料表) カバーされた表面 (約 50 mm x 50 mm) を準備します。クリーンワックス/プラスチックフィルム (材料表) に、以下を追加します (図 2)。 DdH2O の 4 x 10 μ l の滴を加えてください。 希釈したフィブリルまたはモノマー試料の 1 x 10 μ l 滴を添加する。 酢酸ウラニル 2% の 2 x 10 μ l 滴を加えます。 微細な鉗子を使用して、formvar/炭素被覆、メッシュ銅透過電子顕微鏡観察グリッド (材料表) をピックアップします。注: エッジによってグリッドが選択されるようにして、中央のメッシュ部分を避けてください (図 2A)。鉗子がメッシュを触ると、formvar/カーボンコートフィルムが破損し、グリッドのその領域での撮像が不可能になる。 グリッド formvar/カーボンコーティングされた側 (光沢のある側) を ddH の最初の一滴に浮かべます。ピンセットを優しく使用してグリッドを保持し、コーティングされた表面全体が ddH2o に接触するように押し込みます。グリッドを1分間フローティングさせます。 グリッドをピックアップし、グリッドのメッシュ部分に触れることなく、フィルタ紙で ddH2O を離れてウィック。 DdH2o の2番目のドロップの上のようにグリッドを1分間、ddH2o を遠ざけます。 上のように1分間の希釈したフィブリルの滴の上にグリッドを浮かべて、余分に離れてください。 分のウラニル酢酸の最初の滴にグリッドを浮かべて、余分なものを遠ざけます。 1分間酢酸ウラニルの2番目の滴にグリッドをフロート、余分を離れてウィック。 DdH2o の3番目のドロップで上記のようにグリッドを短くし、ddH2o を離れてウィックします。 DdH2o の4番目のドロップで上記のようにグリッドを簡単にフロートさせると、ddH2o を離れてウィックし、できるだけ ddH2o を削除することを確認します。 イメージングまで保存するためのグリッドボックスに転送します。注: グリッドは、イメージングの前に少なくとも5分間乾燥する必要があります。グリッドは、調製後少なくとも1年のために撮像することができ、乾燥した環境で保存する必要があります。 4. チオフラビン T アッセイ 清潔なマイクロ遠心管では、プッの245μ l に5μ l を加えて dPBS を1:50 希釈し、pipet を混ぜます。 別のマイクロ遠心チューブに250μ l の dPBS を加えて、ネガティブコントロールとして機能させる。 DPBS の245μ l に5μ l のモノマーを加えて、モノマー制御として機能させる。 チオフラビン T に250μ l のグリシン緩衝液 (25 μ m チオフラビン T、100 mM グリシン、1% トリトン X-100、pH 8.5) を各サンプルに加え、軽く混ぜる。 Pipet 2 反復、それぞれ200μ l、黒96ウェルプレートに入れます。光退色を防ぐために、プレートを暗闇の中に保管してください。 RT で1時間インキュベートし、450 nm の励起と 510 nm の発光を使用してプレートを読み取ります。注: チオフラビン T の測定値は時間とともに変動します。サンプルは、同じインキュベーション時間で読み取る必要があります。必要に応じて、1時間のインキュベーション中に複数の測定値を取得し、時間をかけてプロットすることができます。 5. α-シヌクレイン予備繊維の超音波処理 注意: sonicator とすべての超音波処理ステップは、超音波処理中に aerosolize することができるフィブリルへの暴露を防止するために、培養フードで実行されます。超音波処理手順を実行する要員は、手袋、白衣の形で衣類の保護、および超音波処理するしながら、顔の盾を含む、個人的な保護具を着用しなければなりません。フィブリル曝露のリスクは、カップホーン sonicator で超音波処理するすることによって低減することができ、フィブリルを含むチューブを超音波処理中に閉じたままにすることができる。 注: フィブリルの最適な超音波処理パラメータは、使用される sonicator のモデルに依存しています。このため、フィブリルが正しいサイズであることを保証するために、いくつかの最適化を行う必要があります。使用される sonicator は材料のテーブルで見つけられ、概説される変数は sonicator のこのモデルとの前の結果に基づいている。以下のパラメータは、200-400 μ l のサイズμ g/μ l の溶液で2-4 動作します。測定器とのテスト超音波処理を行い、所望の結果が実験でサイズの使用前に達成されることを確実にするために分析されるフィブリルが必要です。 3.2 mm の直径のプローブ (材料のテーブル) をコンバーターに取り付け、ステップ 5.1.1-5.1.3 で以下に示すように、sonicator パラメータを設定します。 振幅を 30% に設定します。 パルスを 01 01 に設定します (1 s オン、1 s off)。 時間を0:01:00 に設定します。注: パルスの1分は60パルスに相当し、このモデルの sonicator (材料表) は自動的に停止します。他の sonicator モデルでは、パルスの数を数える必要があります。 RT での dPBS を融解し、培養フード中で無菌の溶液で希釈する。注: 明確な 0.6 mL マイクロ遠心チューブは、超音波処理に最適で、最終のフィブリル濃度は使用目的によって異なります。示された代表的な結果は、最終のフィブリル濃度が4μ g/μ l である。 70% エタノールで湿らせたラボ組織で sonicator のプローブを拭き取り、プローブをクリーニングします。プローブの先端を ddH の2O とパルスに10回沈めて、さらにプローブをきれいにしてから、ラボ組織で拭いて乾かします。 プローブ先端を希釈したフィブリルのチューブに入れ、チューブの底面に先端を置きます。 60パルスのための超音波処理 (1 s on; 1 s オフ)。各パルスの間にプローブを上下に動かして、液体中のすべてのフィブリルが超音波処理されるようにします。きれいで 60の脈拍の後、サイズからのプローブを取り外し、電子顕微鏡によって超音波処理によるフィブリル測定のためのプッフィブリル1:50 をきれいなマイクロ遠心管で dPBS の98μ l に添加した。注: 理想的には、フィブリルの小さなサブセットは、インビボ注入の前に測定されるべきであり、時間が許すときに行われるフィブリルのより包括的な測定である。 超音波処理した後、簡単にチューブの側面からすべての液体を収集するために 2000 x gで 1 s のためにサイズを遠心分離します。注意: チューブが接触して熱くなる場合は、30パルスの後に超音波処理するを停止し、1分間待ってから、最後の30パルスの超音波処理を待ちます。注: 超音波処理する中、プローブ先端を各パルスの開始時に液体の底部に向けておくと、液体の上部に近すぎるとサンプルが失われます。 プローブ先端を 1% SDS に沈め、10回パルスしてプローブをクリーニングします。先端を SDS から取り出し、ddH2O に沈めて10回パルスします。 70% のエタノールで湿らせたラボ組織でプローブを拭いてから、プローブを乾いたラボ組織で拭きます。プローブをコンバーターおよびストアから切り離します。 フード内のすべての表面を 1% SDS で拭き、70% のエタノールを続けます。注: 1% SDS 溶液を使用して、フィブリルと清浄な表面および装置16を解離させる。 超音波処理されたフィブリルの測定のための透過電子顕微鏡 注: 電子顕微鏡検査が実現可能でない場合、チオフラビン T 動力学アッセイ、および動的光散乱は、播種効率およびフィブリルサイズ4、14の間接的な測定として使用できます。 上記の「フィブリル化のための電子顕微鏡検査」セクションのプロトコルを使用してサンプルを準備します。 透過型電子顕微鏡を使用して、6〜10種類の格子開口部からフィブリルの像を撮影する。注: 画像は、フィブリルを測定するのに十分な倍率であるべきであるが、複数のフィブリルを同時に可視化するには十分低い。最終的な倍率は約75倍で十分です。 実験においてフィブリルを使用する前に少なくとも25個のフィブリルの小さなサブセットの長さを測定する。注: これらの測定は、典型的には、顕微鏡に関連する画像化ソフトウェアを使用して行うことができる。迅速な検証のために、測定者は、代表的な細線維を選択し、平均サイズを計算する必要があります。フィブリルの長さは平均約 50 nm 以下で、より正確な測定を行います。 より包括的な結果のために 500 + フィブリルの長さを測定します。注: 顕微鏡に関連するイメージングソフトウェアは、フィブリルの測定に使用することができます。あるいは、画像処理ソフトウェアを用いて測定することができ、フィブリルは、各画像に関連付けられたスケールバーをサイズ基準として用いて、フィブリル化長さを比較することができる。 7. 定位注射用のカスタムガラス針シリンジの調製 (図 3) 清浄な 50 mL ビーカーに約10ml の siliconizing 試薬 (材料表) を加えます。 ガラスキャピラリーチューブ (長さ 54 mm、外径: 0.86 mm、内径 0.59 mm) を siliconizing 試薬のビーカーに垂直に配置し、毛管作用で siliconizing 試薬をチューブ上に沈めて下部チューブ開口部を貫通させます。siliconizing 試薬。 Pipet は、siliconizing 試薬に沈められていない上部管開口部に追加の siliconizing 試薬を注入して、ガラス毛細管を完全に充填します。 Siliconizing 試薬から毛細管を取り出し、ペーパータオルでチューブの開いた端を拭き取り、チューブ内の siliconizing 試薬を除去します。毛管管は少なくとも8時間乾燥させることを許可しなさい。 ガラスの針の引き手にシリコン処理のガラス毛細管を置きます (材料のテーブル)。 加熱素子をオンにし、付属の重量は、加熱されたガラス毛細管を伸ばすことができます。 中央の最も薄い点ではさみで引っ張られたガラス毛細管をカットし、ガラス針の引き手からガラス針を取り外します。注: 引っ張られた針の内径と外径は、それぞれ約80と100μ m でなければなりません。複数のガラス針を一度に作ることができ、付属の金属製の針 (材料のテーブル) とガラス注射器に取り付ける準備が整うまで保存されます。 シュリンクラップチューブの長さ (平均内径 0.021 “と平均壁厚 0.001”) をはさみで約 40 mm にカットします。シュリンクラップを10μ l のベベルしたシリンジ (材料のテーブル) の金属製の針の上にスライドさせます。 針を回転させながら均一に熱を加えるために、開いた炎を使用して、ニードルにシュリンクラップを加熱して接着します。 引っ張られたガラス針の大きい方の端を、シリンジの金属製の針に注意深くスライドさせます。 シュリンクラップチューブ (平均内径 0.036 “と平均壁厚 0.005”) をはさみで約 40 mm に切り、ガラス針の上を慎重にスライドさせて、ガラス針とシリンジの金属針の付け根に重なるようにします (表材料)。開いた炎を使用してシュリンクラップを加熱し、ガラス針を金属製の針に固定します。 ガラスの針を固定するためにシュリンクラップの追加の層を追加します。シュリンクラップチューブ (平均内径 0.044 “と平均壁厚 0.005”) をはさみで約 40 mm に切り、ガラス針の上を慎重にスライドさせて、ガラス針とシリンジの金属針の付け根に重なるようにします (表材料)。開いた炎を使用してシュリンクラップを加熱し、ガラス針を金属製の針に固定します。 先端が約 8 mm の長さになるようにはさみでガラスの針をトリム。注: 針は、所望の脳領域を標的とするのに十分な長さである必要があります (必要な長さは、背/腹部の座標に依存します)。 漏出がないことを保障するために針をテストするのにステップ 7.14.1-7.14.3 を使用し、ガラス針からの液体の引き出しおよび分配の両方に十分な流れがある。 付属の26ゲージニードル付き1Ml のシリンジを dH2O で満たします。 カスタムのガラス製ニードル注射器から金属プランジャーを取り外し、dH2O 充填シリンジの針をシリンジのベースに挿入します。ガラスニードルから dH2O を吐出する圧力をかけます。ガラス針と金属製針の界面に漏れがないか点検し、安定した dH2O の流れを確認します。注: 必要に応じて、ガラス針をトリムして流れの容易さを高め、ガラス針の基部からの漏れをパッチするためにシュリンクラップの追加の層を追加することができます。 マイクロ遠心チューブに dH2o を充填します。カスタムガラスニードルシリンジを使用して、dh2o で描画します。注射器に液体が取り込まれ、気泡がないことを確認するために針を点検する。注: 泡または dH2O が針に引かれていない場合、針をトリミングすることは圧力を軽減するのを助けることができます。 手術のために必要になるまでシリンジに付属のガラス針で注射器を慎重に保管してください。 標準的な stereotaxic 手術法を使用して、マウスの最適化された座標 (1 つの部位: AP + 0.2 mm および ML + intrastriatal から bregma、DV-2.6 mm から硬膜から 2.0 mm)、またはラット (2 つの部位: bregma からの AP + 1.6 mm および ML + 2.0 mm、DV-4.0 から硬膜;AP + 0.1 mm および ML + bregma から 4.2 mm、硬膜からの DV-5.0)1、14、17。注: これらの座標は、C57BL6/C3H マウスおよび Fischer 344 ラットで使用されています。他のひずみを使用する場合は、座標を最適化する必要があります。