Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll für eine On-Membran-Verdauungstechnik zur Vorbereitung von Proben für die Massenspektrometrie vor. Diese Technik erleichtert die bequeme Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen.
Abstract
Zahlreiche intrazelluläre Proteine interagieren physisch in Übereinstimmung mit ihren intrazellulären und extrazellulären Umständen. Tatsächlich hängen die zellulären Funktionen weitgehend von intrazellulären Protein-Protein-Wechselwirkungen ab. Daher ist die Forschung über diese Wechselwirkungen unerlässlich, um das Verständnis physiologischer Prozesse zu erleichtern. Die Ko-Ausfällung assoziierter Proteine, gefolgt von einer Massenspektrometrie-Analyse (MS), ermöglicht die Identifizierung neuartiger Proteinwechselwirkungen. In dieser Studie haben wir Details der neuartigen Technik der Immunpräzipitations-Flüssigchromatographie (LC)-MS/MS-Analyse in Kombination mit der On-Membran-Verdauung für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen bereitgestellt. Diese Technik eignet sich für rohe Immunpräzipitantien und kann den Durchsatz proteomischer Analysen verbessern. Tagged rekombinante Proteine wurden mit spezifischen Antikörpern gefällt; als nächstes wurden Immunpräzipitanten, die auf Polyvinylidendifluorid-Membranstücke gefleckt wurden, einer reduktiven Alkylierung unterzogen. Nach der Trypsinisierung wurden die verdauten Proteinrückstände mit LC-MS/MS analysiert. Mit dieser Technik konnten wir mehrere kandidatenassoziierte Proteine identifizieren. Daher ist diese Methode praktisch und nützlich für die Charakterisierung neuartiger Protein-Protein-Wechselwirkungen.
Introduction
Obwohl Proteine in lebenden Organismen eine konstitutive Rolle spielen, werden sie in der intrazellulären Umgebung kontinuierlich synthetisiert, verarbeitet und abgebaut. Darüber hinaus interagieren intrazelluläre Proteine häufig physikalisch und biochemisch, was die Funktion eines oder beider1,2,3. Beispielsweise ist die direkte Bindung des spliceosomenassoziierten Proteinhomologs CWC22 mit dem eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor 4A3 (eIF4A3) für die Montage des exon-Junction-Komplexes4erforderlich. In Übereinstimmung damit, eine eIF4A3 Mutante, die Affinität für CWC22 fehlt nicht exon Junction komplexe mRNA spleißen4zu erleichtern. Daher ist die Untersuchung von Protein-Wechselwirkungen entscheidend für das genaue Verständnis der physiologischen Regulation sowie der zellulären Funktionen.
Jüngste Fortschritte in der Massenspektrometrie (MS) wurden auf die umfassende Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen angewendet. Zum Beispiel ermöglicht die Ko-Ausfällung von endogenen Proteinen oder exogen eingeführten markierten Proteinen mit ihren zugehörigen Proteinen, gefolgt von einer MS-Analyse, die Identifizierung neuartiger Proteinwechselwirkungen5. Ein großer Engpass bei der MS/MS-Analyse ist jedoch die schlechte Erholung von tryptischen Digests von Proteinproben. Zur Durchführung proteomischer Analysen an Zelllysaten werden in der Regel In-Gel- und On-Membran-Verdauungstechniken zur Vorbereitung von MS/MS-Proben eingesetzt. Wir haben zuvor ein In-Gel-Verdauungsverfahren mit einer On-Membran-Verdauungstechnik6verglichen und gezeigt, dass letztere mit einer besseren Sequenzabdeckung verbunden war. Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membran kann für diesen Zweck geeignet sein, weil es mechanisch robust und beständig gegen hohe Konzentrationen von organischen Lösungsmitteln7,8, ermöglicht die enzymatische Verdauung von immobilisierten Proteine in Gegenwart von 80% Acetonitril9. Darüber hinaus kann die Immobilisierung auf einer Membran konformationale Veränderungen in Denkproteinen auslösen, was zu Verbesserungen der tryptischen Verdauungseffizienz10führt. Dementsprechend haben wir in diesem Artikel die Verwendung von Immunpräzipitation-LC/MS/MS-Analysen von Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membran-Verdauungstechnik beschrieben. Diese einfache Methode erleichtert die bequeme Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen auch in nicht spezialisierten Laboratorien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben zuvor eine Analyse der oxidativen Modifikationen von Apolipoprotein B-100 in oxidiertem Low-Density-Lipoprotein mit LC-MS/MS beschrieben, der eine On-Membran-Verdauungstechnik vorausgegangen ist6. In der vorliegenden Studie haben wir diese Technik mit Immunpräzipitation kombiniert und mehrere Calpain-6-assoziierte Proteine identifiziert. Diese neuartige Technik stellt eine bequeme Methode zum Screening auf Kandidaten-assoziierte Proteine dar. Calpain-6 ist ein nicht-proteolytisches Mitg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde teilweise von der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 17K09869 (to AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 15K09418 (to TM), einem Forschungsstipendium der Kanehara Ichiro Medical Science Foundation, unterstützt. und ein Forschungsstipendium der Suzuken Memorial Foundation (alle an TM).
Materials
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
References
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