تقييم تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لتقنية الهضم على الغشاء لإعداد عينات لقياس الطيف الكتلي. تسهل هذه التقنية التحليل المريح للتفاعلات بين البروتين والبروتين.
Abstract
العديد من البروتينات داخل الخلايا تتفاعل جسديا وفقا لظروفها داخل الخلايا وخارج الخلية. في الواقع، تعتمد الوظائف الخلوية إلى حد كبير على تفاعلات البروتين والبروتين داخل الخلايا. ولذلك، فإن البحوث المتعلقة بهذه التفاعلات لا غنى عنها لتيسير فهم العمليات الفسيولوجية. يمكن التهطول المشترك للبروتينات المرتبطة بها، متبوعًا بتحليل الطيف الكتلي (MS)، تحديد تفاعلات البروتين الجديدة. في هذه الدراسة، قدمنا تفاصيل تقنية جديدة من المناعية هطول الأمطار السائلة الكروماتوغرافيا (LC)-MS / MS تحليل جنبا إلى جنب مع الهضم على الغشاء لتحليل التفاعلات بين البروتين والبروتين. هذه التقنية مناسبة للمناعة الخام ويمكن أن تحسن الإنتاجية من التحليلات البروتيومية. وقد عجلت البروتينات المؤتلفة الموسومة باستخدام أجسام مضادة محددة؛ بعد ذلك، تعرض علماء المناعة المناوئون على قطع غشاء الديفيلوريد البولي فينيليدين إلى الألكلة الاختزالية. بعد التجرب، تم تحليل بقايا البروتين المهضوم باستخدام LC-MS/MS. باستخدام هذه التقنية، تمكنا من تحديد العديد من البروتينات المرتبطة بالمرشح. وبالتالي، فإن هذه الطريقة مريحة ومفيدة لتوصيف التفاعلات الجديدة بين البروتين والبروتين.
Introduction
على الرغم من أن البروتينات تلعب أدوارًا تأسيسية في الكائنات الحية، إلا أنها يتم تصنيعها ومعالجتها وتدهورها باستمرار في البيئة داخل الخلايا. وعلاوة على ذلك، تتفاعل البروتينات داخل الخلايا في كثير منالأحيان جسديا وكيميائيا بيولوجيا، مما يؤثر على وظيفة واحد أو كليهما 1،2،3. على سبيل المثال، الربط المباشر للبروتين المتجانس المرتبط بـ spliceosome CWC22 مع عامل بدء الترجمة eukaryotic 4A3 (eIF4A3) ضروري لتجميع مجمع تقاطع الإكسون4. وتماشيا مع ذلك، فإن متحولة eIF4A3 التي تفتقر إلى التقارب لCWC22 يفشل في تسهيل تقاطع exon معقدة يحركها mRNA الربط4. وهكذا، فإن دراسة تفاعلات البروتين أمر بالغ الأهمية لفهم دقيق للتنظيم الفسيولوجي وكذلك للوظائف الخلوية.
وقد تم تطبيق التطورات الأخيرة في قياس الطيف الكتلي (MS) على التحليل الشامل للتفاعلات البروتينالبروتينية. على سبيل المثال، يمكن الترسيب المشترك للبروتينات الذاتية أو البروتينات ذات العلامات الخارجية مع البروتينات المرتبطة بها، تليها تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد، من تحديد تفاعلات البروتين الجديدة5. ومع ذلك، فإن أحد الاختناقات الرئيسية لتحليل التصلب المتعدد/التصلب المتعدد هو ضعف الانتعاش من الملخصات التربتيكية لعينات البروتين. لإجراء التحليلات البروتيومية على lysates الخلية، وتستخدم عموما في هلام وتقنيات الهضم على غشاء لإعداد عينات MS / MS. لقد قارنا سابقا إجراء الهضم في هلام مع تقنية الهضم على الغشاء6، وأظهرت أن هذا الأخير كان مرتبطا مع تغطية تسلسل أفضل. غشاء ثنائي الفينيل (PVDF) قد يكون مناسبا لهذا الغرض لأنه قوي ميكانيكيا ومقاومة لتركيزات عالية من المذيبات العضوية7،8، مما يسمح بالهضم الأنزيمي للتعطيل البروتينات في وجود 80٪ أسيتوتريل9. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي الجمود على الغشاء إلى تغييرات في البروتينات المستهدفة، مما يؤدي إلى تحسينات في كفاءة الهضم التربتيكي10. وفقا لذلك، في هذه المقالة، وصفنا استخدام تحليل المناعة-LC/MS/MS لتفاعلات البروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء. تسهل هذه الطريقة البسيطة التحليل المريح للتفاعلات البروتينية حتى في المختبرات غير المتخصصة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد سبق لنا وصف تحليل التعديلات التأكسدية للبروتين اللابولي ب-100 في البروتين الدهني منخفض الكثافة المؤكسد باستخدام LC-MS/MS يسبقه تقنية الهضم على الغشاء6. في هذه الدراسة، جمعنا هذه التقنية مع الترسيب المناعي وحددنا العديد من البروتينات المرتبطة بالكالبين-6. هذه التقنية الجديدة ت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذه الدراسة جزئيا من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم KAKENHI منحة رقم 17K09869 (إلى AM)، الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم KAKENHI منحة رقم 15K09418 (إلى TM)، وهي منحة بحثية من مؤسسة كانهارا ايشيرو للعلوم الطبية ومنحة بحثية من مؤسسة سوزوكان التذكارية (جميعها إلى TM).
Materials
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
References
- Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
- Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
- Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
- Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
- Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
- Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
- Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
- Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
- Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
- Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
- Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).
