Оценка взаимодействия белкови-белков с использованием метода пищеварения On-Membrane
Summary
Здесь мы представляем протокол для метода он-мембранного пищеварения для подготовки образцов для массовой спектрометрии. Этот метод облегчает удобный анализ белково-белковых взаимодействий.
Abstract
Многочисленные внутриклеточные белки физически взаимодействуют в соответствии с их внутриклеточными и внеклеточными обстоятельствами. Действительно, клеточные функции во многом зависят от внутриклеточного белково-белкового взаимодействия. Поэтому исследования, касающиеся этих взаимодействий, необходимы для облегчения понимания физиологических процессов. Совместное выпадение связанных белков, за которым и начинается анализ масс-спектрометрии (МС), позволяет выявить новые белковые взаимодействия. В этом исследовании мы предоставили подробную информацию о новой технике иммунопреципиционно-жидкой хроматографии (LC)-MS/MS анализ в сочетании с имбрамбранным пищеварением для анализа белково-белковых взаимодействий. Этот метод подходит для грубых иммунопросицитантов и может улучшить пропускную работу протеомных анализов. Tagged рекомбинантные белки были осаждены с использованием конкретных антител; Далее иммунопроцициты, запятнанные на поливинилиденовые дифлуоридные мембранные части, подвергались редуктивной алкилированию. После трипсиизации, переваренные остатки белка были проанализированы с помощью LC-MS/MS. Используя эту технику, мы смогли определить несколько кандидатов, связанных белков. Таким образом, этот метод удобен и полезен для характеристики новых белково-белковых взаимодействий.
Introduction
Хотя белки играют составную роль в живых организмах, они постоянно синтезируются, обрабатываются и деградируют во внутриклеточной среде. Кроме того, внутриклеточные белки часто физически и биохимически взаимодействуют, чтовлияет на функцию одного или обоих 1,2,3. Например, для сборки комплекса экзонических соединений соединения4необходима прямая привязка сплайсцео-связанного белка омолога CWC22 с эукариотическим фактором инициации перевода 4A3 (eIF4A3). В соответствии с этим, eIF4A3 мутант, который не хватает сродства к CWC22 не может облегчить экзон соединения комплексного мРНК сращивания4. Таким образом, изучение белковых взаимодействий имеет решающее значение для точного понимания физиологических регуляции, а также клеточных функций.
Последние достижения в области масс-спектрометрии (МС) были применены к комплексному анализу белково-белковых взаимодействий. Например, совместное выпадение эндогенных белков или экзогенно введенных помеченных белков с их сопутствующими белками, а затем анализ MS, позволяет выявить новые взаимодействия белка5. Тем не менее, одним из основных узких мест MS / MS анализа является плохое восстановление от триптических дайджестов белковых образцов. Для проведения протеомического анализа на клеточных лизатах, в геле и на мембранном пищеварении методы, как правило, используются для подготовки MS / MS образцов. Ранее мы сравнили процедуру переваривания в геле сметодом пищеварения 6, и показали, что последняя была связана с лучшим покрытием последовательности. Поливилиден дифлуорид (PVDF) мембрана может быть подходящим для этой цели, потому что это механически надежный и устойчивый к высоким концентрациям органических растворителей7,8, что позволяет ферментативное пищеварение обездвижемых белки в присутствии 80% ацетонитрила9. Кроме того, иммобилизация на мембране может вызвать конформанционные изменения в целевых белков, что приводит к улучшению эффективности триптического пищеварения10. Соответственно, в этой статье мы описали использование иммунопреципиции-LC/MS/MS анализа белковых взаимодействий с использованием метода пищеварения на мембране. Этот простой метод облегчает удобный анализ белково-белковых взаимодействий даже в неспециализированных лабораториях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ранее мы описали анализ окислительных модификаций аполипопротеина B-100 в окисленном липопротеине низкойплотности с использованием LC-MS/MS, предшествовавшего методу переваривания на мембране 6. В настоящем исследовании мы объединили эту технику с иммунопрецицией и выявили н…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было частично поддержано Японским обществом содействия науке KAKENHI Грант номер 17K09869 (к AM), Японское общество по содействию науки KAKENHI Грант номер 15K09418 (к TM), научно-исследовательский грант от Kanehara Ichiro Медицинский научный фонд и исследовательский грант от Мемориального фонда Suzuken (все – Tm).
Materials
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
References
- Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
- Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
- Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
- Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
- Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
- Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
- Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
- Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
- Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
- Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
- Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).
