Экспериментальный анализ Апоптотического тимоцита с помощью макрофагов
Summary
Здесь мы представляем протокол для подготовки апоптозных тимоцитов и перитонеальных макрофагов и анализировать эффективность эффофоцитоз и конкретных ингибитор-опосредованной блокировки апоптотического тимоцитов поглощает. Этот протокол имеет широкое применение в клеточной опосредованной зазор других частиц, включая искусственные бусы и бактерии.
Abstract
Апоптоз клеток является естественный процесс и играет решающую роль в эмбрионального развития, гомеостатическое регулирование, индукции иммунной толерантности, и разрешение воспаления. Накопление апоптотического мусора в организме может вызвать хронические воспалительные реакции, которые приводят к системным аутоиммунным заболеваниям с течением времени. Нарушенного апоптотического клеточного допуска был замешан в различных аутоиммунных заболеваний. Апоптотический зазор – это сложный процесс, который редко обнаруживается в физиологических условиях. Она включает в себя обильные поверхностные рецепторы и сигнальные молекулы. Изучение процесса апоптотического клеточного расчистки обеспечивает проницательные молекулярные механизмы и последующие биологические реакции, которые могут привести к развитию новых терапевтических средств. Здесь мы описываем протоколы для индукции апоптотических тимоцитов, подготовку перитонеальных макрофагов, а так же анализ апоптотических клеточных расчистки по течению цитометрии и микроскопии. Все клетки будут подвергаться апоптозу на определенном этапе, и многие жилые и циркулирующих клеток может поглощения апоптотического мусора. Таким образом, описанный здесь протокол может быть использован во многих приложениях для характеризации апоптотического клеточного связывания и проглатывания многими другими типами клеток.
Introduction
Наше тело генерирует 1-10 миллиард апоптотических клеток на ежедневной основе. Такое большое количество апоптотических клеток должно быть очищено таким образом, что иммунные реакции остаются покоя. Для обеспечения очистки апоптотических клеток своевременно, многочисленные виды тканей резидентов клеток и циркулирующих клеток разработать механизмы, чтобы поглотить апоптотических клеток1. Дисфункциональные регулирование апоптоза был замешан в возникновении и прогрессирования различных воспалительных заболеваний и аутоиммунитет2. Апоптоз также играет решающую роль в патогенезе развития рака и его последующее сопротивление традиционным лечения3,4. Удаление апоптотических клеток обычно способствует противовоспалительной реакции, которые могут быть связаны с иммунологической толерантности5. Нарушение апоптотического клеточного расчистки стимулирует самоиммунизацию и способствует развитию системных аутоиммунных заболеваний как у людей, так и у мышей6.
Когда клетки проходят апоптоз, они подвергают воздействию фосфатидилсерина (Птдзер) из внутренней листки в внешнюю брошюру мембраны. Птдзер будет распознан фагоцитами через поверхностные рецепторы. Более десятка рецепторов были определены распознавать и/или способствовать поглощает апоптозных клеток. В общем, есть по крайней мере три типа поверхностных рецепторов, участвующих в апоптосной клеточной очистки: привязывая рецепторы, признают Апоптотические клетки; Щекотка рецепторов, инициировать поглощает; рецепторы, облегчающие весь процесс7. Таминовых рецепторов тирозина (там Риткс) состоят из Tyro-3, AXL, и мER и в первую очередь выражены миелоидных клеток иммунной системы8. Основная функция там Риткс заключается в том, чтобы служить привязывая рецепторы, облегчая фагоцитическое удаление апоптотических клеток и мусора. Наша группа изучила там опосредованный апоптотический клеточный зазор в условиях аутоиммунитета на долгие годы. Витамин к-зависимый рост белка арест специфического белка 6 (Gas6) и белка S (плюсы) связывается и активирует там рецепторы9,10. Gas6 вырабатывается в сердце, почках и легких. Профи в основном производятся в печени11. ТАМ признает апоптозных клеток таким образом, что N-терминал Gas6/профи связывается с Птдзер на апоптотической клетке и C-терминал Gas6/профи связывается с там рецепторов, которые закреплены на поверхности фагоцитов. Вместе с другими рецепторами, поглощает Апоптотические клетки происходит12. Хотя Mer может связываться как с лигандами профи и Gas6, мы обнаружили, что Gas6, как представляется, единственным лигандов для Mer опосредованного фагоцитоза апоптоз клеток, которые могут быть заблокированы анти-Mer антитела13. Макрофаги являются профессиональными гогоцитами. Быстрое оформление апоптозных клеток макрофагами имеет важное значение для ингибирования воспаления и аутоиммунные реакции против внутриклеточных антигенов. Mer рецептор тирозинкиназы имеет решающее значение для затопления макрофагов и эффективного оформления апоптотических клеток14. В селезенке мыши, Mer главным образом выражает на предельной зоне и материальном теле макрофагах13.
Представленный здесь протокол описывает базовый метод индуцирования апоптоза клеток и демонстрирует способы измерения процесса и эффективности эффоцитоза. Эти протоколы могут быть легко адаптированы для изучения эффофоцитоз другими типами клеток в поглощает апоптозных клеток различного происхождения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Апоптоз является высоко консервативны клеточной смерти процесс, который включает в себя множество каскадов сигнала и индуцирует выражение белка, секреции и транспортировки. Апоптоз часто ассоциируется с клеточными изменениями морфологии17. Апоптотические клетки активно…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование в лаборатории Шао поддерживается научно-исследовательской премией от медицинского колледжа и экспериментальной премии младшего факультета от Департамента внутренней медицины, Университета Цинциннати и гранта ДК K01_095067 от NIDDK/НИЗ.
Materials
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
References
- Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).
- Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
- Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).
- Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).
- Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
- Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).
- Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80 (4), 661-670 (1995).
- Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
- van der Meer, J. H., van der Poll, T., van ‘T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).
- Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
- Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).
- Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).
- Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
- Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
- Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
- Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
- Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).
- Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
- Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112 (4), 935-945 (2008).
