هنا ، نقدم بروتوكولا لاعداد الخلايا الدهنية والضامة البريتونية وتحليل كفاءه افيروسيتوسيس والمثبطة المحددة بوساطة عرقله الخلايا الدهنية أحاطه. هذا البروتوكول لديه تطبيق واسعه في الخلية بوساطة أزاله الجزيئات الأخرى بما في ذلك الخرز الاصطناعي والبكتيريا.
الخلية المبرمج هو عمليه طبيعيه ويلعب دورا حاسما في التنمية الجنينية ، وتنظيم التماثل ، والحث التسامح المناعي ، وحل التهاب. تراكم الحطام ابوتوتيك في الجسم قد يؤدي إلى الاستجابات التهابيه المزمنة التي تؤدي إلى امراض المناعة الذاتية الجهازية مع مرور الوقت. تم التورط في أزاله الخلايا الميتة المصابة بامراض المناعة الذاتية. أزاله ابوتوتيك هي عمليه معقده نادرا ما يتم الكشف عنها في ظل الظروف الفسيولوجية. انه ينطوي علي المستقبلات السطحية وفيرة واشاره جزيئات. دراسة عمليه أزاله الخلايا ابوتوتيك يوفر أليات الجزيئية الثاقبة والاستجابات البيولوجية اللاحقة ، والتي قد تؤدي إلى تطوير التداوي الجديدة. هنا ، ونحن وصف بروتوكولات لتحريض الخلايا الدهنية ، واعداد الضامة البريتوني ، وتحليل أزاله الخلايا ابوتوتيك عن طريق تدفق الخلوي والمجهر. وسوف تخضع جميع الخلايا المبرمج في مرحله معينه ، والعديد من الخلايا السكنية والمنتشرة يمكن امتصاص الحطام ابوتوتيك. ولذلك ، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا في العديد من التطبيقات لتوصيف ربط الخلية ابوتوتيك والابتلاع بواسطة العديد من أنواع الخلايا الأخرى.
جسمنا يولد 1-10 مليار خليه ابوتوتيك علي أساس يومي. يجب مسح مثل هذا العدد الكبير من الخلايا ابوتوتيك بطريقه ان الاستجابات المناعية لا تزال هادئه. لضمان أزاله الخلايا ابوتوتيك في الوقت المناسب ، وأنواع عديده من الخلايا المقيمة الانسجه والخلايا المتداولة تطوير أليات لابتلاع الخلايا ابوتوتيك1. وقد تورط تنظيم مختلة من موت الخلايا المبرمج في بداية وتطور مختلف الامراض التهابيه والحصانة الذاتية2. المبرمج أيضا يلعب دورا حاسما في التسبب في تطور السرطان ومقاومتها اللاحقة للعلاجات التقليدية3,4. أزاله الخلايا ابوتوتيك عموما يعزز استجابه مضاده للالتهابات ، والتي قد تكون مرتبطة بالتسامح المناعي5. اضطرابات أزاله الخلايا ابوتوتيك يدفع التمنيع الذاتي ويساهم في تطوير امراض المناعة المناعية الجهازية في كل من البشر والفئران6.
عندما الخلايا الخضوع للخلايا المبرمج, انها تعرض فوسفاتيديلسيرين (PtdSer) من النشرة الداخلية إلى النشرة الخارجية لغشاء. ثم سيتم التعرف علي PtdSer من قبل الخلايا الشحمية من خلال مستقبلات السطح. وقد تم تحديد أكثر من اثني عشر مستقبلا للاعتراف و/أو تسهيل أحاطه الخلايا الميتة. بشكل عام ، هناك ما لا يقل عن ثلاثه أنواع من المستقبلات السطحية المشاركة في أزاله الخلايا ابوتوتيك: مستقبلات الربط ، والتعرف علي الخلايا ابوتوتيك. المستقبلات دغدغه ، والشروع في أحاطه ؛ المستقبلات المشقوقة ، وتسهيل العملية برمتها7. [تام] مستقبلات [تيروزين] [كيناسيس] ([تام] [رتكس]) يتالف [ر] [ترو-3], [اكس], و [م] وعبر عن في الدرجة الاولي ب [ميلينويد] خلايا من ال [ايمون سستم]8. الوظيفة الرئيسية لل RTKs تام هو ان تكون بمثابه مستقبلات الربط ، وتسهيل أزاله الفاغميه من الخلايا ابوتوتيك والحطام. وقد درست مجموعتنا تام بوساطة أزاله الخلايا ابوتوتيك في وضع المناعة الذاتية لسنوات عديده. نمو البروتين المعتمدة علي فيتامين ك القبض علي بروتين محدد 6 (Gas6) والبروتين S (الإيجابيات) بربط وينشط مستقبلات تام9,10. يتم إنتاج Gas6 في القلب والكلي والرئتين. يتم إنتاج الإيجابيات أساسا في الكبد11. يدرك تام من الخلايا ابوتوتيك في مثل هذه الطريقة ان N-الطرفية من Gas6/الإيجابيات بربط PtdSer علي خليه ابوتوتيك والطرفية C من Gas6/الإيجابيات بربط مستقبلات تام التي ترتكز علي سطح الخلايا الشحمية. بالاضافه إلى المستقبلات الأخرى ، يحدث أحاطه الخلايا الميتة12. علي الرغم من ان مير يمكن ربط كل من الإيجابيات يغاندس و Gas6 ، وجدنا ان Gas6 يبدو ان الحرف الوحيد لالبلعمه مير بوساطة الضامة من الخلايا ابوتوتيك ، والتي يمكن حظرها من قبل المضادة–مير الأضداد13. الضامة هي البالعات المهنية. التخليص السريع للخلايا ابوتوتيك من قبل الضامة مهم لتثبيط التهاب والاستجابات المناعية الذاتية ضد المستضدات داخل الخلايا. مستقبلات مير التيروزين كيناز أمر بالغ الاهميه لأحاطه الضامة والتخليص الفعال للخلايا ابوتوتيك14. في الطحال الفار ، ويعبر مير أساسا علي المنطقة الهامشية والضامة الجسم ملموسه13.
يصف البروتوكول المعروض هنا أسلوبا أساسيا للحث علي الخلايا المبرمجة للخلايا ويوضح طرق قياس العملية وكفاءه افيروسيتوسيس. ويمكن تكييف هذه البروتوكولات بسهوله لدراسة الافيروسيتوسيس من قبل أنواع الخلايا الأخرى في أحاطه خلايا ابوتوتيك من أصول مختلفه.
المبرمج هو عمليه الموت خليه المحفوظة للغاية التي تنطوي علي العديد من الشلالات اشاره ويدفع التعبير البروتين, إفراز, والنقل. المبرمج غالبا ما يرتبط مع التغيرات المورفولوجية الخلوية17. الخلايا ابوتوتيك الإفراج بنشاط السايتوكينات والكيميائية التي تجذب البالعات للهجرة إلى الموق…
The authors have nothing to disclose.
ويدعم البحث في مختبر شاو من قبل جائزه البحوث المبتكرة من كليه الطب والجائزة التجريبية كليه المبتدئين من قسم الطب الباطني ، جامعه سينسيناتي ومنح DK K01_095067 من NIDDK/المعاهد الوطنية للصحة.
Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
CFSE | Invitrogen | C1157 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |