אנליזה ניסויית של האפוטוטיק הפיקרוציט על ידי המקפאגים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להכין thymocytes, מקרופאגים הצפק ולנתח את היעילות של efferocytosis ואת החסימה בתיווך מעכבי של האפוטוציטים thymocytes שתבלע. פרוטוקול זה יש יישום נרחב בסיווג התא-תיווך של חלקיקים אחרים כולל חרוזים מלאכותיים וחיידקים.
Abstract
ואפופטוזיס תא הוא תהליך טבעי וממלא תפקיד קריטי בפיתוח עובריים, רגולציה הומסטטית, עמידות החיסונית אינדוקציה, ורזולוציה של דלקת. הצטברות של פסולת אפוטוטית בגוף עלולה לגרום לתגובות דלקתיות כרוניות המובילות מחלות אוטואימוניות מערכתית לאורך זמן. . מעורב במגוון מחלות אוטואימוניות סיווג האפוטוטיק הוא תהליך מורכב שנדיר לעתים רחוקות בתנאים פיזיולוגיים. זה כולל קולטני שטח שופע מולקולות איתות. לימוד התהליך של הסיווג התא האפוטוטיק מספק מנגנונים מולקולריים תובנה ותגובות ביולוגיות עוקבות, אשר עשוי להוביל לפיתוח של therapeutics חדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עבור אינדוקציה של thymocytes האפוטוציטים, הכנת מקרופאגים הצפק, וניתוח של הסיווג התא האפוטוטיק על ידי הזרמת cy, ומיקרוסקופ. כל התאים יעברו אפופטוזיס בשלב מסוים, ומגורים רבים במחזור התאים יכולים ספיגה של פסולת אפוטוטית. לכן, הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש ביישומים רבים כדי לאפיין את כריכת התא האפוטוטית ובליעה של סוגים רבים של תאים אחרים.
Introduction
הגוף שלנו מייצר 1-10 מיליארד תאי האפוטוטיים על בסיס יומי. מספר גדול של תאים אפוטוטיים חייב להיות מתנקה באופן שהתגובות החיסונית יישארו בשקט. כדי להבטיח את הסיווג של תאים האפוטוטיים בזמן, סוגים רבים של תאים תושב רקמות ותאים מחזורי לפתח מנגנונים לתאי האפוטוטיים מפרץ1. רגולציה מתפקדת של אפופטוזיס כבר מעורב בתחילתה והתקדמות של מחלות דלקתיות שונות החסינות האוטומטית2. אפופטוזיס גם משחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של התפתחות הסרטן ההתנגדות הבאה שלה טיפולים קונבנציונליים3,4. הסרת תאים אפוטוטיים מקדמת בדרך כלל תגובה אנטי דלקתית, אשר עשויה להיות מקושרת לסובלנות החיסונית5. הפרעה של הסיווג תא האפוטוטיק כוננים חיסון עצמי תורמת לפיתוח של מחלות אוטואימוניות מערכתית בבני אדם ועכברים6.
כאשר התאים עוברים ואפופטוזיס, הם חושפים את הפוספלדיסרין (פטין) מתוך העלון הפנימי אל העלעל החיצוני של הקרום. לאחר מכן יהיה מזוהה על ידי phagocytes באמצעות קולטני פני השטח. למעלה מתריסר קולטנים זוהו לזהות ו/או להקל על הבזלת של תאים אפוטוטיים. באופן כללי, ישנם לפחות שלושה סוגים של קולטני פני השטח המעורבים בסיווג התא האפוטוטית: הקולטנים קולטני, לזהות תאים אפוטוטיים; לדגדג קולטנים, ליזום שתבלע; קולטנים למשגיחים, להקל על התהליך כולו7. שיטת הקולטן טאם (TAM RTKs) מורכבת מ- Tyro-3 , Xl, ו- Mer והם מבוטאים בעיקר על ידי תאים מיאלואידים של מערכת החיסון8. התפקיד העיקרי של TAM RTKs הוא לשמש קולטנים הקשירה, הקלה על הסרת phagocytic של תאים אפוטוטיים ופסולת. הקבוצה שלנו למדה את הסיווג של התאים טאם בתיווך במסגרת החסינות האוטומטית במשך שנים רבות. הגידול ויטמין K התלוי חלבון מעצר מסוים חלבון 6 (Gas6) וחלבון S (היתרונות) נקשר ומפעיל את קולטני טאם9,10. Gas6 מופק בלב, הכליות, והריאות. מקצוענים מיוצרים בעיקר בכבד11. TAM מזהה בתאים אפוטוטיים בצורה כזאת, כי N-מסוף של Gas6/המקצוענים נקשר לפטין על תא האפוטוטיק ואת C-מסוף של Gas6/המקצוענים נקשר לקולטני TAM המעוגן על פני השטח של phagocytes. יחד עם קולטני אחרים, הבזים של תאים אפוטוטיים מתרחש12. למרות Mer יכול לאגד הן מומחי ליגנדס ו Gas6, מצאנו כי Gas6 מופיע להיות ligands עבור מר בתיווך מקרופאג phagocyציטוזה של תאים אפוטוטיים, אשר ניתן לחסום על ידי נוגדן אנטי מאר13. מקרופאגים הם phagocytes מקצועי. סיווג מהיר של תאים אפוטוטיים על ידי מקרופאגים חשוב עיכוב של דלקת ותגובות אוטואימוניות נגד אנטיגנים תאיים. קולטן מר טירולך קינאז הוא קריטי עבור מקרופאג הבזים וסיווג יעיל של תאים אפוטוטיים14. בטחול העכבר, Mer מבטא בעיקר על אזור שולי מקרופאגים גוף מוחשי13.
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה בסיסית כדי לגרום אפופטוזיס התא ולהפגין דרכים למדוד את התהליך ואת היעילות של efferocytosis. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים בקלות כדי ללמוד efferocytosis על ידי סוגי תאים אחרים בתוך שתבלע של תאים אפוטוטיים של מקורות שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אפופטוזיס הוא תהליך שימור מאוד תאים מוות המערבת הרבה אותות מפלי ומשרה ביטוי חלבון, הפרשה, ותחבורה. אפופטוזיס קשורה לעיתים קרובות עם שינויים מורפולוגיה הסלולר17. תאים אפוטוטיים משחררים ציטוקינים ונוגדנים שמושכים phagocytes כדי לעבור לאתר וליזום את תהליך של שריפת, מסלול מורכב מאוד ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר במעבדת האלה נתמך על ידי מחקר של פרס חדשני של המכללה לרפואה ואת הפרס טייס הפקולטה זוטר מהמחלקה לרפואה פנימית, אוניברסיטת סינסינטי וגרנט DK K01_095067 מ NIDDK/NIH.
Materials
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
References
- Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).
- Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
- Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).
- Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).
- Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
- Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).
- Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80 (4), 661-670 (1995).
- Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
- van der Meer, J. H., van der Poll, T., van ‘T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).
- Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
- Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).
- Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).
- Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
- Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
- Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
- Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
- Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).
- Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
- Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112 (4), 935-945 (2008).
